规律成簇间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein, CRISPR/Cas)系统是一种广泛存在于细菌和古生菌中的免疫防御系统，近年来，得益其对核酸靶标的精准识别与切割能力，CRISPR/Cas系统在病原微生物快速检测方面显现出巨大潜力。基于CRISPR/Cas系统开发的病原微生物检测技术较之传统分子检测技术，往往更具特异性和灵敏度或者与其相当。通过与重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification，RPA)、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)等核酸扩增技术结合，这类病原微生物检测技术能够达到更高的灵敏度，甚至实现单碱基差异的区分。依赖于可编程的引导RNA，CRISPR/Cas系统能够实现对不同的目标进行检测。因此基于CRISPR/Cas系统开发病原微生物快速检测技术是目前乃至未来检测技术开发的一个重要方向。本文对近年来基于CRISPR/Cas系统建立的代表性快速检测技术类型进行梳理总结。此外基于引导RNA的设计在创建新型CRISPR/Cas检测技术中的重要性，本文对部分Cas蛋白引导RNA的特点、设计规则以及特异性靶标序列的获取进行了重点讨论，以期能够为开发基于CRISPR/Cas系统新型病原微生物快速检测技术提供一定的参考和依据。

1 基于CRISPR/Cas的病原微生物检测系统 1.1 基于CRISPR/Cas的核酸检测技术的工作原理

CRISPR/Cas系统是一种细菌与古细菌的免疫防御系统，由CRISPR序列和Cas基因组成。CRISPR序列包含上游的前导序列、间隔序列以及重复序列，其中间隔序列为CRISPR/Cas系统靶向目标的特异性序列，是CRISPR/Cas系统实现对靶标序列精准切割的关键^{[ 1]}。CRISPR序列能够通过一系列加工与修饰成为靶向特定序列的引导RNA。Cas蛋白由cas基因编码，成熟的Cas蛋白效应器为单个蛋白或者为多个蛋白形成的复合物，具有靶向切割功能^{[ 2]}。Cas蛋白能够在其引导RNA的带领下，首先对目标进行前间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif，PAM)/前间隔序列侧翼位点(protospacer flanking site，PFS)的识别，识别完成后，Cas蛋白会在与引导RNA中间隔序列互补的序列处进行切割，这一行为被称为顺式切割。基于此原理，将部分Cas蛋白例如Cas9与其他生物传感方式相连接，就能够通过识别某一病原微生物的特异性核酸序列来能够实现对它的快速检测。目前已经鉴定的CRISPR/Cas系统按照其蛋白效应物的作用结构可分为2大类，第一类CRISPR/Cas系统包含多种执行单一功能的Cas效应蛋白，需要这些Cas蛋白相互协作来完成靶标序列的识别和切割过程；第二类CRISPR/Cas系统则是使用单个多功能的Cas蛋白来识别和切割靶标序列^{[ 3]}，Cas9、Cas12、Cas13等均属于第二类Cas蛋白。随着研究不断深入，研究者发现除顺式切割活性以外，Cas12、Cas13以及Cas14蛋白还具有反式切割活性，即当Cas蛋白与引导RNA、靶标序列形成三元复合物后，Cas蛋白的反式切割活性会被激活，从而能够对反应体系中游离的核酸序列进行无差别切割^{[ 4]}。不同Cas蛋白顺式切割与反式切割偏好的底物存在差异( 表 1)。针对不同病原微生物，设计相应的引导RNA，在引导RNA的引导下，利用Cas蛋白顺式切割活性对靶标序列进行切割，再将反式切割活性与各种信号读取方式结合来放大检测结果从而实现结果的快速读取，这是目前基于CRISPR/Cas系统核酸检测技术的基本工作原理与流程( 图 1)。

1.2 基于CRISPR/Cas的核酸检测技术的信号读取方法

利用Cas蛋白反式切割活性来切割反应体系中游离的荧光探针，进而通过荧光的强弱来进行结果的判定是最为常见的一种CRISPR/Cas检测技术类型。Cas蛋白反式切割活性还能与电化学信号、侧向流动试纸等信号读取方式结合，来实现目标核酸的快速检测。此外，CRISPR/Cas检测技术与LAMP、RPA等核酸扩增技术结合，能够有效富集检测目标，提高检测的灵敏度与特异性，进一步拓宽检测范围。在基于CRISPR/ Cas的核酸检测技术中，构建简单直观的信号读取方式至关重要，因此本文对常见应用于CRISPR/Cas检测技术中的信号读取方式进行了总结。

1.2.1 光学信号读取

通过将反式切割信号转换为更易于观察的光学信号是构建基于CRISPR/Cas系统病原微生物检测技术最常见的方法之一。如上部分所述，Cas12、Cas13以及Cas14蛋白具有反式切割活性，能够将反应体系中的游离DNA/RNA进行切割，因此可以将DNA/RNA设置成双端带有荧光基团和荧光猝灭基团的探针。在对靶标进行切割后，Cas蛋白反式切割活性被激活并对荧光探针进行切割，导致荧光基团和荧光猝灭基团分离，从而发出荧光，通过特定光源的照射，可以裸眼观察到检测结果( 图 2)。荧光探针法是目前最为常见的CRISPR/Cas检测系统的信号读取方式。例如Gootenberg等^{[ 5]}报道的SHERLOCK系统正是基于此原理，在反应体系中设置荧光探针，通过前期的扩增步骤，成功实现对寨卡病毒和登革热病毒的检测。将靶标序列与荧光染料结合发出荧光来实现检测是另一种信号转换方式。例如Guk等^{[ 6]}报道了一种CRISPR介导的DNA-FISH方法，该方法使用SYBR Green Ⅰ作为荧光染料去定向结合反应体系中的靶标，实现了30 min内对耐甲氧西林葡萄球菌的快速检测。比色传感是另一种常见的应用于CRISPR/Cas检测技术中的光学信号读取方式。AuNP是该方法中常见的信号输出媒介。AuNPs的聚集与分散会影响吸收峰的变化，与此同时溶液会显示出明显的颜色变化。基于这一特性，Zhang等^{[ 7]}设计了DNA-AuNPs复合体，当SARS-CoV-2靶标被切割后，Cas12a反式切割活性被激活，导致AuNPs上的DNA降解从而引起AuNPs的聚集。AuNPs的聚集引起的吸收峰变化以及溶液颜色变化可以通过紫外可见吸收光谱或者肉眼快速直观地观察到。此外TMB^{[ 8]}、ABTS^{2–[ 9]}等比色染料也已应用于CRISPR/Cas检测技术的开发。

1.2.2 电化学信号读取

电化学信号相较于其他信号读取方式，更为快速灵敏。目前已有E-CRISPR概念的提出，即通过将CRISPR/Cas系统与电信号读取模式相结合，形成一体式的集成系统，来实现现场病原微生物的快速检测^{[ 10‒ 11]}。电化学信号的输出与读取通常是利用Cas蛋白反式切割活性对电化学标签进行切割，从而引起一系列变化实现信号的波动( 图 3)。例如Zhang等^{[ 12]}设计了一种由MB组成的发卡状DNA报告分子。由于其特殊的茎环结构，该报告分子会靠近金电极的表面，产生较高的氧化还原反应。而当Cas12反式切割活性被激活后，该报告分子茎环结构会因蛋白切割而被破坏，从而离开金电极表面。金电极表面报告分子的释放会导致峰值电流的降低，从而区分于原先的高峰值电流实现检测。E-CRISPR未来的构建需要更多地与计算工具相结合以提高信号的灵敏度与准确度，而非目前简单的数字信号转化^{[ 13]}，此外目前报道的E-CRISPR往往缺乏临床验证，这依赖未来更多的临床验证以确保其在现场检测中的可行性。

1.2.3 侧向流动读数

侧向流动分析技术主要通过抗原-抗体相互作用或者DNA杂交来实现信号输出和读取( 图 4)。CRISPR/Cas系统与侧向流动技术进行结合能够有效增加CRISPR/Cas检测技术现场检测的实用性。目前有大量基于CRISPR/Cas系统的病原微生物检测技术通过侧向流动试纸来实现结果的快速读出^{[ 14]}。例如Gootenberg等^{[ 15]}报道的SHERLOCKv2系统，在该系统中研究者巧妙设计了一种不依赖任何设备的侧向读数系统。在该系统中，报告序列两端标记了生物素和FAM荧光素。在侧向流动纸测试条上，报告基序的荧光素与纸条上被金纳米颗粒标记的抗FAM抗体结合形成复合物，但纸条的第一条线处(标记C的位置)含有链霉亲和素，可与报告序列的生物素结合，在靶标序列不存在的情况下，检测序列积累在侧向流动测试条的第一行。而当靶标序列存在时，Cas蛋白的反式切割活性被激活，报告序列被切割，FAM及其抗体复合物就会流向带有二抗的第二条测试线(标记T的位置)，从而产生清晰的检测信号。针对侧向流动试纸读数结果可能存在显色模糊、难以判定的情况，相关的量化应用程序也已经被开发，并被证明可以提供更为清晰无误的诊断读数^{[ 16]}。针对部分病原微生物的CRISPR/Cas检测技术总结如 表 2所示。

2 引导RNA的结构特点与设计规则

在常见用于病原微生物检测的几种Cas蛋白中，每种Cas蛋白使用的引导RNA的结构特点均有所不同。Cas9蛋白在天然状态下需要在trans activating CRISPR RNA (tracrRNA)- CRISPR RNA (crRNA)双RNA引导下进行切割^{[ 48]}。成熟的引导RNA通常包含75 nt的tracrRNA和39‒42 nt的crRNA；其中crRNA包含了能够特异性靶向细菌的间隔序列以及重复序列( 图 5)。tracrRNA包含与重复序列配对的部分序列以及3个发卡结构，这一结构特点至关重要，研究表明，Cas9蛋白需要识别引导RNA上的发卡结构以及重复-反重复双链结构才能与特定的引导RNA进行结合^{[ 49]}。将crRNA的3′端与tracrRNA的5′端通过一个短序列进行连接，形成环路，同时保留tracrRNA-crRNA的二级结构可以形成单引导RNA (sgRNA)^{[ 50]}。合成的sgRNA与天然双RNA能够同样引导Cas9蛋白进行特异性切割。sgRNA由2个部分组成，分别是能够与目标DNA特异性结合的靶标序列(protospacer)以及固定的scaffold序列^{[ 51]}。与天然结构的引导RNA一样，间隔序列位于重复序列前面^{[ 52]}，所以引导Cas9的sgRNA的protospacer同样位于scaffold序列的前端，通过更换不同的protospacer，能够靶向不同的目标DNA。scaffold序列具有与天然结构类似的二级结构且不同来源的sgRNA的scaffold序列组成有所不同，这对于Cas9蛋白识别特定的引导RNA具有重要作用。sgRNA的整体结构包括间隔区、下茎、凸起、上茎、连接和发夹6个模块。6个模块行使着不同功能来帮助Cas蛋白完成靶标的切割，例如凸起与连接是裂解DNA过程中不可缺少的，而连接与发夹则有助于系统之间的正交性等^{[ 53]}。引导RNA由可变的protospacer与恒定的scaffold序列组成，因此在进行设计时这2个部分就是考虑的主要因素。Protospacer的长度对于整个切割活动影响巨大，包含过长或过短protospacer序列的引导RNA无法发挥正常功能。通常20 nt长度protospacer与scaffold序列相连接就可以引导Cas9对靶标进行切割检测^{[ 54‒ 56]}。但这长度也并非固定，例如在Zhang等^{[ 57]}报道的基于dCas9病原微生物检测平台中，使用(21±2) nt长度的protospacer都能达到很好的检测效果。而对于Cas9以及其他Cas蛋白恒定的scaffold序列而言，在序列正确的前提下通过体外转录等方式就可以得到具有正确空间结构的scaffold序列。此外对引导RNA进行修饰也能够进一步提高靶向效果，例如靠近引导RNA的5′位置添加额外2个鸟嘌呤核苷酸^{[ 58]}，或者是在特定位置添加化学修饰的核苷酸^{[ 59]}。

Cas12a不依赖tracrRNA和核糖核酸酶RNase Ⅲ来产生成熟的crRNA。其本身具有核糖核酸酶功能，能够完成对pre-crRNA的切割，从而形成中间体crRNA并最终形成成熟的crRNA^{[ 60]}。由于缺少tracrRNA，Cas12a的crRNA长度明显短于Cas9的sgRNA。首次在新弗朗西斯菌中发现的CRISPR/Cas12a系统显示，其成熟的crRNA长度为42‒44 nt，其中部分直接重复序列长19‒20 nt，间隔序列长度为23‒25 nt^{[ 61]}。在直接重复序列的3′端处，通过碱基配对作用，形成了1个茎环结构( 图 5)。这一结构与Cas9引导RNA的3个发卡结构有着显著的不同。茎环结构对于Cas12a蛋白与crRNA结合起着关键作用，Cas12a蛋白需要通过识别茎环结构特征和序列特征来识别crRNA^{[ 61]}。crRNA的茎环结构高度保守，来自不同细菌的Cas12a系统的crRNA都有着相同或类似的茎环结构。这也使得同源细菌的crRNA可以彼此更换直接重复序列使用而不会影响crRNA的活性。与Cas9类似的是，在PAM位点旁边同样存在对于蛋白与目标特异性结合起着关键作用的种子序列，长度较Cas9较短，通常为5‒6 nt^{[ 60, 62]}。对于Cas12a而言，包含20 nt长度的protospacer序列的引导RNA能够高效地引导Cas蛋白来实现检测^{[ 11, 63‒ 64]}，但是该长度并不是唯一的黄金准则，21 nt^{[ 65]}、24 nt^{[ 20]}等长度的protospacer序列也在不同的检测系统中展现出较高的效率。同样地对引导RNA的结构进行修饰能够有效提高检测的效率，例如对于LbCas12a而言，在其引导RNA的5′或3′进行7 nt DNA长度的延伸修饰，能够将LbCas12a反式切割活性提高3.5倍，并且这种提高是通用的，不依赖特定的protospacer序列^{[ 2]}。

Cas12b与Cas12a不同，为双RNA引导的DNA内切酶。来自不同菌种的Cas12b引导RNA长度有着一定的差异，例如在酸热脂环芽孢杆菌中，Cas12b引导RNA包含crRNA与tracrRNA，其中crRNA长34 nt，包含5′端14 nt直接重复序列和20 nt的间隔序列，79 nt的tracrRNA与经过处理的14 nt重复序列能够形成一个稳定的二级结构^{[ 66]}。而在短芽孢杆菌观察到Cas12b的crRNA中直接重复序列长27 nt，间隔序列为38 nt，tracrRNA为99 nt。与其他CRISPR系统类似，在Cas12b所偏好的PAM位点附近观察到种子序列的存在，位于PAM位点下游3‒6 nt处^{[ 67]}。与Cas9类似，通过将crRNA与tracrRNA融合得到sgRNA，能够实现在体外引导Cas12b进行切割。在Cas12b的引导RNA中，protospacer的长度通常为20 nt^{[ 44, 68‒ 69]}。然而当检测的病原微生物靶标序列极其接近，需要进行单碱基差异的区分时，20 nt便不再是最佳的protospacer长度。当检测目标为ssDNA时，16 nt或17 nt的protospacer序列最佳；当目标为dsDNA时，18‒20 nt的protospacer序列最佳^{[ 70]}。

对于Cas13而言，单一的crRNA就可以引导切割。在李斯特菌中首次发现Cas13相关基因座，将其在大肠杆菌中表达显示crRNA包含5′端29 nt的直接重复序列以及15‒18 nt的间隔序列，未发现tracrRNA的表达。这种直接重复序列在前，间隔序列在后的排列方式在Cas13家族的crRNA中并不唯一，例如对于Cas13b而言，其直接重复序列位于间隔序列的3′端，与Cas13a的crRNA排列顺序相反^{[ 71]}。Cas13的crRNA采用较为简单的结构，直接重复序列形成了单一的环状手柄结构，在其两端则是长度可变的间隔序列^{[ 72‒ 73]} ( 图 5)。对于大部分Cas13a诸如LwCas13a来说，引导RNA中protospacer合适长度通常为28 nt^{[ 74‒ 76]}，而LbuCas13a的protospacer长度为20 nt较为合适^{[ 15]}。引导RNA的设计复杂，目前并没有统一的标准，目前的部分规则也只是基于已报道的CRISPR/Cas检测技术上总结而来，实际构建过程中，设计多个引导RNA并通过实验进行筛选仍然是最佳的方法。 表 3总结了常见Cas蛋白引导RNA的部分设计规则。

3 病原微生物特异性靶标的获取

CRISPR/Cas介导的病原微生物快速检测技术对检测目标的高特异性一方面得益于不同Cas蛋白偏好不同的PAM/PFS序列，另一方面引导RNA所携带的protospacer也是识别的关键。此外通过更换引导RNA来实现对不同目标的检测主要是通过更换引导RNA中protospacer来实现，因此在构建基于CRISPR/Cas的病原微生物检测系统时，获取特异性良好的protospacer至关重要。特异性良好的protospacer首先需要在检测目标中高度保守，以保证能够对病原微生物检出。此外这段序列要在除检测目标以外的所有物种中都不存在，以排除检测过程中假阳性结果。对于大部分病原微生物来说，都会存在保守性好、特异性强的特异性检测基因，诸如沙门菌invA基因^{[ 26]}、副溶血弧菌tlh基因^{[ 46]}、单核增生李斯特菌prfA基因^{[ 79]}等。这些基因通常已经被鉴定和报道，并且在PCR、荧光定量PCR等其他分子检测方法中已被用来鉴定目标病原菌。因此这些基因都可以用来寻找合适的protospacer。由于不同Cas蛋白需要识别PAM位点才能后续进行引导RNA与靶标的结合，因此可以通过扫描不同的PAM位点附近合适长度的序列来作为候选的protospacer，将候选的protospacer进行在线以及本地BLAST来确定特异性较好的protospacer。在扫描PAM位点时候，需注意不同Cas蛋白识别的PAM位点与引导RNA中protospacer特异性结合的序列位置不一致，例如Cas9所识别的PAM位点位于与protospacer互补序列的后端，而Cas12a所识别的PAM位点则位于与protospacer互补序列的前端。部分检测技术使用此逻辑设计了高特异性的引导RNA，用于病原微生物的检测。例如You等^{[ 80]}报道的基于Cas12a所建立鼠疫耶尔森菌的快速检测技术，在进行crRNA设计时，选用鼠疫耶尔森菌的4个检测靶点基因，对检测基因进行了Cas12a所偏好的“TTTN”的PAM位点的筛选。设计3–5个crRNA进行测试，选择效率最高的进行后续实验。在确定好的靶向基因后，还可以进一步使用序列比对工具例如DNAMAN、DNASTAR等进行比对，找出高度保守区域，这样更有利于快速寻找protospacer。例如Yu等^{[ 81]}在设计鉴定隐孢子虫IId子类型(SF)引导RNA时，在获取不同的SF的序列后，使用ClustalX 2.1进行比对，确定了SF高保守区域。选择PAM位点后面的一段高特异性序列作为protospacer。

在缺乏已经报道的靶标或者是在报道的靶标位点上找不到合适的protospacer时，一些报道详细的生物信息学分析流程能够为找寻合适的靶标提供思路。研究者通常将目标基因组与亲缘关系接近的物种进行比对，以期获得新的特异性靶点。例如在Williams等^{[ 82]}报道的鉴定大西洋鲑鱼的CRISPR/Cas快检技术中，研究者将大西洋鲑鱼与其亲缘关系最为接近的2种鲑鱼科成员的线粒体基因组进行比对来设计crRNA，并通过BLAST比对确保crRNA的高特异性。在部分亲缘关系非常相近，难以进行很好区分的病原微生物靶标筛选过程中，则需要根据情况进行更加灵活的筛选。例如Chen等^{[ 83]}报道了一种鼠疫耶尔森菌特异靶点的筛选流程( 图 6A)，研究者在获取了鼠疫耶尔森和其他耶尔森氏菌的基因组数据之后，以鼠疫耶尔森CO92为标准菌株，通过自己编写的python脚本将基因组划分成若干100 nt的DNA片段。将这些DNA片段通过局部BLAST比对，来筛选出在所有鼠疫耶尔森菌中均有分布的片段。在获得DNA片段之后，将DNA片段组合成非重叠的长DNA片段。随后使用MEGA-X软件将其他耶尔森菌中与这些长DNA片段的同源序列进行比对，从而得到能将鼠疫耶尔森与其他耶尔森菌区分开SNP位点。将包含多个SNP位点的DNA片段进行BLAST在线比对，证实能够对鼠疫耶尔森菌进行很好的鉴定，这些包含SNP位点的DNA片段即为新的检测靶点。本实验室同样开发了一套找寻特异性靶标的生物信息学分析流程，并成功应用于对空肠弯曲菌的特异性靶标的找寻( 图 6B)。在美国国家生物技术信息中(National Center of Biotechnology Information，NCBI) 获取弯曲菌的基因组数据后，以空肠弯曲菌标准株或者以结肠弯曲菌标准株为参考，使用FastANI计算平均核苷酸相似度(average nucleotide identity, ANI)来进行物种鉴定和亲缘关系判定，并通过使用了Seqkit amplicon算法进行原位PCR分析来获得高质量的空肠弯曲菌以及结肠弯曲菌的基因组。将空肠弯曲菌与结肠弯曲菌的序列进行比对可以获得特异性靶标。在比对中首先使用了mlst软件进行多位点分型，挑取ST型中具有代表性的菌株序列使用Neptune软件进行比对，得到的特异性靶标序列通过在线BLAST以及本地BLAST进行特异性的验证^{[ 44]}。综合不同分析流程来看，高质量的基因组是分析的必要条件，因为可能存在错误注释分类的基因组数据或者无明确物种注释信息等情况影响后续的分析。基因组的比对要在检测目标与其亲缘关系最为接近的物种之间进行，因为这是后续最影响检测结果的物种。针对不同比对软件或者算法，基因组可能要进行适当的拆分。得出的特异性靶标序列需要再次在检测目标与其他物种基因组中进行验证以保证其保守性和特异性。此外无论是新型挖掘的病原微生物特异序列还是已经频繁报道的特异序列，其长度都可能较长。而引导RNA的protospacer则较短，因此从特异基因中选取的protospacer可能因为长度的减少，而导致其物种特异性的降低。而将CRISPR/Cas检测技术通过与前期的扩增步骤进行结合，则能够有效缓解这一问题，特异序列的核酸扩增能够对后续CRISPR/Cas检测的目标范围进行有效划分，通过富集目标病原微生物的特异性序列，从而进一步保证CRISPR/Cas检测的特异性。

4 展望与总结

CRISPR/Cas系统通过与不同的信号读取方式相结合，使其在病原微生物即时诊断方面展现出巨大优势。但是与世界卫生组织提出的理想即时诊断标准^{[ 84]}相比，基于CRISPR/Cas系统建立的检测技术仍然存在很大发展空间。例如目前已开发的CRISPR/Cas检测技术主要通过荧光强弱来读取结果，荧光探针自身的背景值可能会影响低浓度样品结果的判定，如何进一步排除荧光背景值影响，实现对低浓度阳性样品更准确地判定是至关重要的问题。此外荧光的读取依赖荧光激发及检测设备，这增加了现场检测的设备携带负担，如何最大程度减少设备依赖，设置更为简易直观的信号读取方式也是未来CRISPR/Cas检测技术开发的一个重要方向。本文所论述的引导RNA的设计同样是开发基于CRISPR/Cas系统病原微生物快速检测技术的重要问题之一。性能优良的引导RNA能够使得检测变得高效而灵敏，但是检测目标特异性靶标的选择，protospacer序列长度、scaffold序列二级结构对于切割活动的影响等问题都使得引导RNA的设计成为一个值得思考的问题。目前有研究给出Cas13d蛋白的引导RNA的设计规则^{[ 85]}，然而进行此类研究需要大量的数据支撑，对于其他蛋白的引导RNA的设计虽然也有部分报道，但更多还在不断的探索之中。因此，研发制定完善的引导RNA的设计规则也是未来开发新型CRISPR/Cas检测技术的一个重要方向。