2023, Vol. 63中国科学院微生物研究所，中国微生物学会
文章信息
- 卢金连, 张丽珊, 刘子秋, 宋欢欢, 吴昊炜, 林向民. 2023
- LU Jinlian, ZHANG Lishan, LIU Ziqiu, SONG Huanhuan, WU Haowei, LIN Xiangmin.
- 嗜水气单胞菌中类组蛋白HupB生理功能的研究
- Physiological function of histone-like HupB in Aeromonas hydrophila
- 微生物学报, 63(7): 2656-2667
- Acta Microbiologica Sinica, 63(7): 2656-2667
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文章历史
- 收稿日期：2022-10-10
- 网络出版日期：2023-04-12
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引用本文 |
2. 福建农林大学 作物生态与分子生理重点实验室，福建 福州 350002;
3. 福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002
2. Key Laboratory of Crop Ecology and Molecular Physiology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China;
3. College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, Fujian, China
细菌类组蛋白(HU)在细菌中广泛分布，通过对细菌染色体DNA的压缩或者拓扑结构重排，参与DNA的复制、分离和转录过程，从而在多个生理功能中起重要的调节作用[ 1]。HU蛋白主要包括α和β两种亚基，分别由hupB和hupA编码，HupA和DNA结合有关并能在DNA构象改变时对DNA进行重塑[ 2]，会损害艰难梭菌(Clostridium difficile)的生存能力，而HupB其C端结构域对DNA结合至关重要[ 3]。已有研究报道，HupB在维持细菌正常生理功能中也起着重要的作用。例如，柑橘溃疡病菌中hupB基因的缺失，导致细菌生物被膜生成能力以及细菌毒性侵染能力显著下降[ 4]。此外，还有研究表明，HupB蛋白在细菌的耐药性、抗UV辐射以及铁离子动态平衡调控中起重要的调控作用[ 5- 7]。但是，目前该蛋白对细菌生理功能的影响尚不完全清楚。
嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是水产养殖中的一种重要病原体，广泛存在于水生动物、水和土壤环境中[ 8]。该菌作为一种条件致病菌，在淡水鱼养殖中可引起大规模淡水鱼败血症[ 9]，其引起的流行病爆发每年在全球造成数百万美元的经济损失，严重影响水产养殖业的健康发展[ 10]。为了更好地理解hupB基因对嗜水气单胞菌生理功能的影响，本研究利用同源重组的原理构建了嗜水气单胞菌ATCC 7966敲除菌株hupB (AHA_2014)，以评估其对细菌生理表型的影响。进一步结合定量蛋白质组学技术，分析比较缺失菌株和野生型菌株之间的差异表达蛋白，最后通过生物信息学和表型差异的分析，探讨HupB蛋白在嗜水气单胞菌中可能参与的生物过程及其分子调控机制，为该病原菌的防控策略提供新的思路。
1 材料与方法 1.1 材料本研究所用菌株[嗜水气单胞菌ATCC 7966和大肠杆菌(Escherichia coli)]及质粒均保存于本实验室，菌株均用LB培养基培养。本研究所用的化学试剂均为分析纯。绵羊血购于索莱宝生物科技公司；细菌基因组总DNA提取试剂盒、Sac I和Xba I限制性内切酶均购于宝生生物工程(大连TaKaRa)有限公司；细菌质粒提取试剂盒购买于OMEGA；DNA聚合酶、氯霉素(chloramphenicol, Chl)和氨苄青霉素(ampicillin, Amp)均购于上海翊圣生物科技有限公司；多片段无缝连接酶购于南京诺唯赞生物科技有限公司；核酸染料、甘油、蔗糖和琼脂糖(agarose B, Low EEO)均购于生工生物工程(福建)股份有限公司。
1.2 细菌培养和收集从–80 ℃冰箱中取出甘油管保存的细菌菌株，划线于平板中，待长出单克隆菌株后，挑取单克隆至5 mL LB的试管中，放置在30 ℃恒温摇床以200 r/min振荡培养16 h；将该菌液按照1% (体积分数)的比例转至含5 mL LB的试管中，于30 ℃恒温摇床以200 r/min振荡培养至OD600为1.0左右，12 000 r/min高速离心1 min收集菌体，然后用pH 7.4的1×磷酸缓冲液(phosphate buffered solution, PBS)洗涤菌体3次。
1.3 敲除、补救和空载菌株的构建本研究敲除菌株的构建利用同源重组的方法进行[ 11]。在嗜水气单胞菌ATCC 7966野生型(wild type, WT)基因组中hupB基因(AHA_2014)上下游500 bp左右处设计引物P1、P2、P3和P4 (上游引物：P1/P2；下游引物：P3/P4)。将上下游各500 bp的片段扩增出来并连接到已双酶切好的质粒(酶切位点：Xba I、Sac I)中，转入大肠杆菌MC1061感受态细胞中，于37 ℃恒温摇床以200 r/min振荡培养1.0–1.5 h后涂布于含有Chl的固体LB平板中。从验证正确的MC1061中提取质粒，再转入大肠杆菌S17中，于37 ℃恒温摇床以200 r/min振荡培养16 h。将含有质粒的S17细菌与嗜水气单胞菌ATCC 7966进行结合，通过20%蔗糖培养基筛选，并在目的基因两端及上下游600 bp处设计引物，分别为P5/P6及P7/P8，进行PCR验证，最后进行测序比对获得正确的敲除菌株ΔhupB。为了构建空载菌株(ΔhupB: : vector)，将pBBR1-MCS1质粒通过电穿孔将其转入到敲除菌株ΔhupB中；为了构建补救菌株(ΔhupB: : ΔhupB)，首先在嗜水气单胞菌hupB基因N端构建6×His标签，并连接到pBBR1-MCS1质粒中，然后通过电穿孔将其转入到敲除菌株ΔhupB中，补救菌株和空载菌株均用pBBR1- MCS1通用引物(pBBR1-MCS1-F/pBBR1-MCS1-R)验证(研究中使用的各引物见 表 1)。
| Primer name | Primer sequence (5′→3′) |
| P1 | CATGAATTCCCGGGAGAGCTCTGATGTGGCCATGACGGG |
| P2 | CCGGCTCTTATATTCCCCTTTTATCGAACATC |
| P3 | AAGGGAATATAAGAGCCGGGCGCTGATATCAC |
| P4 | CGATCCCAAGCTTCTTCTAGACTCATCGCTGACGCGCAG |
| P5 | GCCATGGCTGATATCGGATCCGTGAATAAATCTCAACTGATTGAC |
| P6 | CTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTAGTTGACAGCGTCTTTCAGGG |
| P7 | GGATCTTCCAGAGATCCGACTTCTACGAGAAGCGC |
| P8 | CTGCCGTTCGACGATGGCGGATCAGCTGCAGATAG |
| hupB-F | GTCGACGGTATCGATAAGCTTCCGGTTCGCTGGATTGACG |
| hupB-R | CGCTCTAGAACTAGTGGATCCGTTGAATGGTGATGGTGATGATGCAGCGTCTTTCAGGGCCTTACC |
| pBBR1-MCS1-F | GCGCGCAATTAACCCTCACTAAAG |
| pBBR1-MCS1-R | GCGCGCGTAATACGACTCAC |
1.4 细菌溶血性和胞外蛋白酶活性的测定
配制含0.8%或1.0%琼脂粉的LB固体培养基，121 ℃灭菌20 min，待培养基冷却至室温后，向培养基中加入7 mL绵羊血或1% (质量体积分数)脱脂牛奶并混匀倒入平板中；凝固后用10 μL移液枪吸头在每个平板中打3个孔，而后将培养至OD600为1.0的菌液吸取10 μL于孔中，在30 ℃培养箱中倒置平板培养16 h，进行细菌溶血性和细菌胞外蛋白酶活性的测定。测量以上蛋白酶或溶血环的大小直径，并独立重复3次。
1.5 细菌生物被膜形成能力测定利用结晶紫染色法检测细菌的生物被膜形成能力[ 12]。将培养至OD600为1.0的菌株用新鲜的LB培养基按1:100稀释，取200 μL菌液加入96孔板中，每个样品设置8个重复组，30 ℃培养24 h。次日取出96孔板，去除培养液并用蒸馏水洗涤3次，室温干燥。而后加入200 μL甲醇，静置15 min，弃甲醇，用蒸馏水洗涤3次，室温风干。然后，在每个孔中加入200 μL 0.1% (质量体积分数)结晶紫溶液，室温下染色20 min后去除多余的染液，并用蒸馏水洗涤3次，室温干燥。最后每孔加入220 μL 95% (体积分数)乙醇溶液，室温孵育10 min。用SpectraMaxⓇ i3多功能微孔板检测OD595处的吸光度，最后导出数据处理并进行显著性差异分析，并独立重复3次。
1.6 细菌泳动和爬动能力检测分别配制0.3%和0.6% (质量体积分数)琼脂的LB培养基，121 ℃灭菌20 min，待培养基冷却至室温后倒平板，吹干，用无菌移液枪吸头挑取相同大小的单克隆点在平板中，于30 ℃培养6–8 h后测量泳动和爬动圈的大小直径，并独立重复3次。
1.7 菌体蛋白的质谱(LC-MS/MS)测定按照1% (V/V)的比例转接过夜菌至20 mL LB液体培养基中，于30 ℃、200 r/min培养至OD600为1.0，离心，弃上清，用PBS缓冲液洗涤菌体3次，将菌体重悬于0.5 mL的细胞裂解液中，超声破碎至溶液接近澄清，4 ℃、18 000×g离心15 min，收集上清，用Broadfrod试剂盒(江苏康为世纪生物科技股份有限公司)测定蛋白的浓度，然后参照过滤辅助样品制备(filter-aided sample preparation, FASP)方法进行酶解[ 13]。将酶解得到的脱盐肽样品溶于含0.1%甲酸的乙腈中，并通过EasynLC 1200 (Thermo Scientific)加入色谱柱，然后利用Orbitrap Fusion Lumos质谱仪进行蛋白的鉴定与定量，MS扫描模式为数据相关采集(DDA)。MS/MS采用30%的HCD碰撞能量和375–1 600的扫描范围(m/z)。对每个样本重复扫描3次。利用MaxQuant软件(2.0.3.1版本)分析原始MS数据，设置嗜水气单胞菌ATCC 7966为数据库进行搜索，多肽和蛋白质错误发现率(FDR)界限值均设置为0.01，并且设定每种蛋白质鉴定至少有2个唯一的肽匹配。选择ΔhupB与WT的蛋白丰度比差异(ratio) > 1.5倍，且每个样品各3次生物学重复之间的Student’s t检验P值< 0.05的蛋白作为差异表达蛋白(differential expression proteins, DEPs)。
1.8 生物信息学分析利用在线网站DAVID ( https://david.ncifcrf.gov/)进行差异表达基因的基因本体论(gene ontology, GO)分析，并对结果进行可视化及绘图[ 14]；使用Cytoscape (v3.9.1)软件中的STRING插件进行蛋白质间的相互作用网络预测，并利用MCODE插件按照默认设定进行聚类分析[ 15- 16]。
1.9 蛋白质印迹法(Western blotting)利用实验室已有抗体，通过Western blotting方法对质谱数据中部分蛋白的差异表达进行验证。首先，通过SDS-PAGE胶对蛋白进行分离，将蛋白用BIO-RAD (trans-blot turbo)半干膜转移仪(90 V, 35 min)转移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上。加入脱脂牛奶封闭后加入一抗(实验室制备的已有抗体，1:5 000)，4 ℃孵育过夜，用PBST洗膜5次，每次5 min；加入二抗(兔抗，1: 5 000)，室温孵育1 h，用PBST洗膜5次，每次5 min。最后用Western ECL底物(BioRad)检测通过蛋白质印迹形成的膜，并使用Image Lab软件(BioRad)在ChemiDoc MP成像系统(BioRad, Hercules)上曝光并进行可视化。
2 结果与分析 2.1 hupB敲除、空载和补救菌株的构建利用自杀质粒pRE112的两步同源重组方法构建了基因突变株ΔhupB。如 图 1A所示，泳道1为hupB上下游引物P7和P8扩增片段，与WT的总DNA相比(泳道2)，扩增片段的长度相差约300 bp，泳道4显示ΔhupB中目的基因P5/P6的相应序列无法扩增，测序结果表明hupB被成功敲除。泳道5和6分别显示回复和空载菌株构建成功。
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| 图 1 嗜水气单胞菌hupB基因敲除、空载和回复菌株的构建和常见生理表型评估 Figure 1 Construction of hupB gene knockout strain of Aeromonas hydrophila and the evaluation of its common physiological phenotypes. A: Construction of hupB gene knockout strain of Aeromonas hydrophila. M: DL 2000 marker; lane 1: WT-P7/P8 (1 486 bp); Lane 2: ΔhupB-P7/P8 (1 213 bp); Lane 3: WT-P5/P6 (273 bp); Lane 4: ΔhupB-P5/P6; Lane 5 and 6: PBBR1-MCS1 universal primers (pBBR1-MCS1-F/pBBR1-MCS1-R) were used to verify the no-load and rescue respectively. B–D: The determination of hemolytic, extracellular protease and biofilm formation activities, respectively. Data represent the mean±SEM of three independent replicates; Significant difference (*: P < 0.05; ***: P < 0.001). E–H: Measurement of swarming and swimming ability, respectively. |
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2.2 ΔhupB对嗜水气单胞菌溶血和细胞外蛋白酶(ECPase)活性的影响
嗜水气单胞菌的致病性与毒力因子密切相关，可严重影响鱼类的健康，而溶血活性和外毒素是嗜水气单胞菌的重要毒力因子。本研究的表型分析表明，与野生型菌株相比，ΔhupB菌株的溶血性( 图 1B)和ECPase活性( 图 1C)均显著升高，而补救菌株ΔhupB: : hupB的溶血性和ECPase活性均低于空载菌株ΔhupB: : vector，提示hupB可能对嗜水气单胞菌的毒力起负调控作用。
2.3 ΔhupB对嗜水气单胞菌生物被膜形成的影响嗜水气单胞菌是革兰氏阴性菌，细胞膜结构比革兰氏阳性菌复杂，其生物被膜由复杂的成分组成，包括脂多糖、磷脂、外膜蛋白和脂蛋白，虽然仅仅是一层薄膜，但对细菌的生理生化起重要作用[ 17]。本研究利用结晶紫染色法测定WT和ΔhupB菌株的生物被膜形成能力，结果发现，与对照相比，ΔhupB的生物被膜形成能力显著降低了12.4%，而补救菌株ΔhupB: : hupB生物被膜形成能力恢复( 图 1D)，说明hupB基因参与调控细菌生物被膜的形成过程。
2.4 ΔhupB对嗜水气单胞菌迁移能力的影响细菌的爬行和游动主要由鞭毛的转动带动细菌向有利的生存环境移动，而细菌的运动能力与嗜水气单胞菌的致病性密切相关。本研究利用0.3%和0.6%的半固体LB平板检测野生型和hupB基因缺失嗜水气单胞菌的泳动和集群运动能力。结果表明，与WT相比，hupB敲除后显著增强了细菌的爬动( 图 1E)和游动能力( 图 1F)，而补救菌株ΔhupB: : hupB爬动和泳动能力与野生型相似，提示hupB基因可能负调控嗜水气单胞菌的迁移能力。
2.5 利用LC-MS/MS比较WT与ΔhupB菌株的差异表达为了更好地了解hupB基因对嗜水气单胞菌生物学功能的影响，本研究提取了WT和ΔhupB突变菌株的蛋白质样品，经过还原、烷基化处理，酶解成多肽后，进行定量蛋白质组学分析，共鉴定出2 654个蛋白。热图( 图 2A)显示，每组样品各3个生物学重复之间存在较强的正相关性(R > 0.94)，表明本研究质谱定量分析结果稳定可靠。此外，以WT为对照，以P < 0.05，差异倍数[log2 (ΔhupB/WT)]≥1.5或≤0.667为标准，共筛选出459个差异表达蛋白，其中上调表达235个，下调表达224个( 图 2B)。部分差异表达蛋白见 表 2。
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| 图 2 定量蛋白质组学数据分析 Figure 2 Quantitative proteomics analysis. A: Quantitative proteomics analysis the correlations among three biological repeats between ΔhupB and wild-type A. hydrophila. B: Volcano plot of differential expression proteins. A：ΔhupB与野生型嗜水气单胞菌蛋白质组学数据3次生物学重复相关性分析. B：差异蛋白的火山图 |
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| Accession | Gene | Descriptions | P-value | log2 (ΔhupB/WT) |
| A0KJU4 | hupB | DNA-binding protein HU-beta | 2.01E-17 | –8.157 99 |
| A0KLR0 | AHA_2703 | Glutamate synthase [NADPH] large chain | 2.13E-13 | –2.152 73 |
| A0KJ51 | purL | Phosphoribosylformylglycinamidine synthase | 1.04E-15 | –1.780 56 |
| A0KJK9 | AHA_1929 | Succinate-CoA ligase [ADP-forming] subunit beta | 3.16E-17 | –1.564 59 |
| A0KHC0 | AHA_1130 | Outer membrane protein | 8.40E-18 | –1.081 54 |
| A0KLP2 | AHA_2685 | Outer membrane lipoprotein | 3.00E-12 | –1.078 58 |
| A0KLK9 | AHA_2651 | Inner membrane protein YoaE | 1.55E-07 | –1.033 92 |
| A0KQV7 | AHA_4236 | Cytochrome c5 | 9.22E-14 | –1.020 9 |
| A0KQZ7 | yidC | Membrane protein insertase YidC | 1.22E-14 | 1.459 80 |
| A0KP92 | pal | Peptidoglycan-associated protein | 4.80E-13 | 1.805 88 |
| A0KFG8 | AHA_0461 | TonB-dependent siderophore receptor | 2.42E-13 | 1.916 53 |
| A0KQ97 | rpsG | 30S ribosomal protein S7 | 6.60E-22 | 1.959 85 |
| A0KF44 | rpsD | 30S ribosomal protein S4 | 5.52E-20 | 1.965 40 |
| A0KF34 | rpsN | 30S ribosomal protein S14 | 3.99E-17 | 2.043 14 |
| A0KF46 | rplQ | 50S ribosomal protein L17 | 2.30E-16 | 2.045 46 |
| A0KF28 | rplP | 50S ribosomal protein L16 | 2.43E-19 | 2.176 39 |
| A0KF27 | rpsC | 30S ribosomal protein S3 | 5.93E-18 | 2.360 40 |
| A0KN14 | nifJ-2 | Flavodoxin oxidoreductase | 0.000425 | 2.445 85 |
| A0KF42 | rpsM | 30S ribosomal protein S13 | 2.69E-21 | 2.561 21 |
| A0KQ98 | rpsL | 30S ribosomal protein S12 | 6.17E-15 | 3.125 98 |
| A0KKP6 | rplT | 50S ribosomal protein L20 | 1.31E-16 | 3.277 27 |
| A0KF24 | rplB | 50S ribosomal protein L2 | 1.39E-23 | 3.557 85 |
2.6 差异表达蛋白GO富集分析
本研究对差异表达蛋白(differential expression proteins, DEPs)进行进一步的GO富集分析，发现差异表达的蛋白质主要集中在生物细胞过程、小分子代谢过程、有机酸代谢过程、含氧酸代谢过程等多个生物过程(BP)上，其中主要集中于小分子、有机酸代谢过程( 图 3A)。此外， 图 3B显示差异蛋白在催化活性、杂环化合物结合、有机环化合物结合和小分子结合等分子功能(molecular function, MF)中富集，说明HupB蛋白可能主要参与与催化活性相关蛋白的合成或生物学过程，提示HupB蛋白涉及多个复杂生物学功能的调控。
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| 图 3 GO生物信息学分析 Figure 3 GO based bioinformatics analysis of differential expression proteins between ΔhupB and WT. A: Clustering enrichment of biological processes. B: Clustering enrichment of molecular function. |
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2.7 差异蛋白质相互作用网络预测
为了更好地了解DEPs的蛋白质-蛋白质互作网络，利用Cytoscape软件并结合STRING与MCODE插件，进一步预测DEPs的蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction prediction, PPI)网络。 图 4显示具有代表性的5个PPI网络聚类，包括核糖体亚基相关蛋白(38个蛋白)、调控生物被膜形成蛋白(10个)、信号传导蛋白(8个)、肽转运蛋白(7个)与氧化磷酰化蛋白(6个)。其中核糖体亚基相关蛋白大部分(定量蛋白质组学分析共鉴定到核糖体亚基相关蛋白55个，其中38个表达上调，17个无明显差异)在ΔhupB中表达上升，调控生物被膜形成蛋白、信号传导蛋白、肽转运蛋白和氧化磷酰化蛋白(除AHA_2859外)则在ΔhupB中表达下调。以上研究表明，hupB的缺失可以引起涉及细菌蛋白质翻译、生物被膜生成等多个重要生物学功能蛋白的变化，提示HupB对嗜水气单胞菌的生理功能具有重要的调控作用。
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| 图 4 具有代表性的差异蛋白质互作预测网络 Figure 4 Selected protein-protein interaction prediction (PPI) networks of DEPs in this study. Different colors represent different protein abundance ratios (log2). |
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2.8 蛋白质组学数据验证
为了验证定量蛋白质组学数据的可靠性，本研究使用了具有代表性的6种差异表达蛋白(A0KQV7、A0KJK9、A0KP92、A0KF42、A0KQZ7和A0KFG8)的特异性抗体进行蛋白免疫印迹验证。结果表明，与对照菌株相比，hupB突变株中A0KQV7和A0KJK9蛋白表达下调，而A0KP92、A0KF42、A0KQZ7和A0KFG8均上调，这与本研究的定量蛋白质组学结果基本一致( 图 5)，这也证实质谱数据具有良好的可靠性。Western blotting中的6种蛋白功能如 表 2所示。
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| 图 5 蛋白质印迹验证蛋白质组学数据 Figure 5 The validation of proteomics analysis results by using Western blotting. The corresponding sample was stained with Coomassie brilliant blue as the control on the left, the Western blotting results are on the right. The ratios in the figure indicate the ratio in proteomics data. |
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3 讨论
嗜水气单胞菌HupB氨基酸序列与大肠杆菌HU-β亚基蛋白同源性较高，同属于DNABII家族，被称为核仁相关蛋白(NAPs)。Sharadamma等[ 18]的研究发现，结核杆菌的hupB不仅可以保护DNA免受Dnase Ⅰ和羟自由基的裂解，而且当hupB基因缺失时，其不能在巨噬细胞中存活[ 7]，说明HupB基因可以显著影响细菌的生存能力。另有文献报道当土拉热弗朗西斯菌中hupB基因缺失时，该菌在小鼠体内和体外的毒力显著减弱，提示HupB还可以调控细菌的毒力[ 19]。为研究hupB基因的生物学功能，本研究以嗜水气单胞菌为研究对象，成功敲除了hupB基因并对其常见表型进行测定。通过比较野生型和ΔhupB的溶血性和ECPase活性，发现该基因缺失导致细菌溶血圈和水解圈显著增大，补救菌株的溶血性和ECPase活性与野生型基本一致，提示hupB编码蛋白可能负调控细菌的溶血性外毒素和胞外蛋白酶的分泌，与嗜水气单胞菌的毒性相关。进一步对差异蛋白的GO分析比较发现，hupB编码的蛋白质与杂化化合物、有机环化合物、小分子化合物的结合以及多个代谢途径有关。
表型测定结果还表明，hupB缺失突变菌株显著降低生物被膜的形成水平，并且补救后生物被膜形成能力恢复。Conforte等[ 4]对柑橘黄单胞菌的生物被膜结构组织进行激光共聚焦扫描显微镜(confocal laser scanning microscope, CLSM)扫描发现，ΔhupB突变菌株附着到非生物表面的能力较野生型减少约60%，且与典型成熟生物被膜不同的是突变菌株只能观察到生长于物体表面上的单层细胞；又有研究报道HupB在柑橘溃疡病菌生物被膜形成中发挥重要作用[ 4]，这与本研究的观察结果一致。此外，本研究中的蛋白质组学分析还发现嗜水气单胞菌ΔhupB突变株与野生型之间的DEPs中有10个生物被膜形成相关蛋白表达下调，提示HupB蛋白可能通过正调控这些蛋白的表达，在嗜水气单胞菌的生物被膜形成过程中发挥作用。
4 结论综上所述，本文构建了嗜水气单胞菌hupB的缺失菌株，通过比较发现缺失株与野生株之间的胞外蛋白酶活性、溶血活性、运动能力和生物被膜形成能力存在显著性的差异，并且比较发现补救菌株的生物被膜形成能力恢复，表明该基因的缺失可能影响嗜水气单胞菌的多个生理功能。进一步通过定量蛋白组学技术，研究hupB缺失后对细菌生物学功能的影响，并试图解释其影响生物被膜生成的分子机制。以上研究将有助于加深对嗜水气单胞菌HupB生物学功能及其分子调节机制的了解，并为预防与控制该病原菌提供理论基础。
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