通用探针法荧光定量PCR试剂盒

用途： 公司产品仅用于科研

纯度： 详见说明书 %

产地： 进口、国产

品牌： 帛科

包装规格： 50T

货号： BKP7311

是否进口： 是

探针荧光定量PCR试剂盒原理分析如下图:

概述:
产品仅供科研使用荧光定量PCR的基本原理就是在PCR扩增过程中,随着PCR循环数的递增,PCR产物不断积累,荧光信号也会相应的增加,这样就可以通过荧光强度的变化来对PCR反应进行实时的监测。本公司根据您的科研需求可以提供SYBR Green染料法和TaqMan探针法。通过对DNA或RNA的荧光定量PCR监测, 实现基因的相对定量、定量和定性分析。

实时荧光定量PCR:
实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限,实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度,并记录在电脑软件之中,通过对每个样品Ct值的计算,根据标准曲线获得定量结果。因此,实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的:
1)Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时,刚刚进入真正的指数扩增期(对数期),此时微小误差尚未放大,因此Ct值的重现性极好,即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增,得到的Ct值是恒定的。
2)Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系,可利用标准曲线对未知样品进行定量测定,因此,实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。
外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确,重现性*的定量方法,已得到全世界的公认,广泛用于基因表达研究、转基因研究,药物考核、病原体检测等诸多领域。

使用方法:
一、通用探针法荧光定量PCR试剂盒稀释PCR阳性对照(以10E2-10E7拷贝/μL这6个10倍稀释度为例)
1. 注意:产品仅供科研使用由于标准品浓度非常高,因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行,千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分)。为增加产品稳定性和避免扩散病原,本产品不提供活体样品做阳性对照,只提供可以直接使用的DNA片段作为阳性对照。
2. 标记6个离心管,分别为7,6,5,4,3,2。
3. 用带芯枪头分别加入45 μL荧光PCR专用模板稀释液(用带芯枪头,下同)。
4. 在7号管中加入5 μL 1×10E8拷贝/μL 的阳性对照,充分震荡1分钟,得1×10E7拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
5. 换枪头,在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得),充分震荡1分钟,得1×10E6拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
6. 换枪头,在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL的阳性对照到5号管中,充分震荡1分钟,得1×10E5拷贝/μL的阳性对照。放冰上待用。
7. 重复上面的操作直到得到6个稀释度的阳性对照。放冰上待用。
二、样品DNA的制备
8. 如果有N个样品,必须设置N+2个提取,多出的一个是PC(样品制备阳性对照),一个是NC(样品制备阴性对照)。可以用10μL上步制备的PCR阳性对照的第4号(浓度为1×10E4 拷贝/μL,10μL相当于1万拷贝)或第5号(浓度为1×10E5 拷贝/μL,10μL相当于10万拷贝)再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样,以此作为PC。另外用水作为NC。如果每次制备需要200μL样品,则PC和NC的体积也必须是200μL。
9. 用自选方法纯化样品的DNA,本试剂盒跟市场上大多数病毒DNA提取试剂盒兼容。
三、设置qPCR反应(20 μL体系,在样品制备室进行)
10. 如果只做1次重复,则标记N+9个PCR管,其中N+2个用于上步得到的N+2个样品,1个用于PCR阴性对照,6个用于PCR阳性对照。如果做2-3次重复,则反应设置数量相应增加2或3倍。
11. 产品仅用于科研在标记管中按下表加入各成分(本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照,并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后加)

荧光定量PCR服务:
简介:实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出,该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,而且与常规PCR相比,它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点,目前该技术已被广泛用于检测细胞mRNA表达量的变化;比较不同组织的mRNA表达差异;验证基因芯片,siRNA干扰的实验结果等。我公司为您提供全套实时荧光定量PCR技术服务,全部实验皆使用进口试剂完成,主要定量PCR仪器。
1、荧光定量PCR服务要求:
(01)请您提供新鲜的且尽量多的材料;或直接提供纯化好的总RNA(大于 5 ug/样品);或直接提供纯化好的DNA(大于 5 ug/样品)。
(02)请提供已知的全长基因序列。
(03)请提供尽可能详细的背景资料:DNA/RNA 来源等
2、荧光定量PCR操作程序
(01)引物(探针)设计与合成。
(02)提取DNA/RNA,样本逆转录成cDNA。
(03)进行Real Time PCR实验,进行实验结果分析。
(04)实验完成后,提供完整的实验报告(含软件分析结果)及引物等实验材料。
3、荧光定量PCR的收费标准:
  我公司根据客户的样品数量进行不同的收费标准。

实验过程:
一、试剂准备
1. DNA模板
2.对应目的基因的特异引物(在PCR反应中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能继续按照模板DNA复制,而不能从无到有,凭空合成。这一小段序列就是你所要有设计的引物。可以是DNA也可以是RNA,一般20多bp,需要根据你的模板链设计。因此,扩增不同的基因需要设计不同的引物)
3.10×PCR Buffer
4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5.Taq酶
二、操作步骤
1.在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1(10pM)               2μl
引物2(10PM)              2μl
Taq酶(2U/μl)            1μl
DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl
加ddH2O至               50 μl
视PCR仪有无热盖,不加或添加石蜡油。
2.调整好反应程序。将上述混合液稍加离心,立即置PCR仪上,执行扩增。一般:在93℃预变性3-5min,进入循环扩增阶段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循环30-35次,zui后在72℃ 保温7min。
3.结束反应,PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
4.PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100μlLuFang进行抽提反应混合液,以除去石蜡油;否则,直接取5-10μl电泳检测。
三、注意事项
1.PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。zui好设立一个专用的PCR实验室。
2.纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。一般而言,只要能够得到可靠的结果,纯化的方法越简单越好。
3.所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。
4.PCR试剂配制应使用zui高质量的新鲜双蒸水,采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。
5.试剂都应该以大体积配制,试验一下是否满意,然后分装成仅够一次使用的量储存,从而确保实验与实验之间的连续性。
6.试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子,玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。
7.PCR的样品应在冰浴上化开,并且要充分混匀。
CM-R034大鼠肝动脉内皮细胞完全培养基100mL1-氮杂-15-冠-5-(>98.0%(T))质量规格:>98.0%(T)1-Aza-15-crown 5-Ether

SGC-7901/VCR细胞,人耐VCR胃腺癌细胞 人神经细胞,BT-325细胞 SV40转化的非洲绿猴肾细胞;COS-71-氮杂-18-冠-6-(>98.0%(GC)(T))质量规格:>98.0%(GC)(T)1-Aza-18-crown 6-Ether

COS-7(非洲绿猴SV40转化的肾细胞) 5×106cells/瓶×21-氮杂-12-冠4-(>98.0%(T))质量规格:>98.0%(T)1-Aza-12-crown 4-Ether

CA12 Others Human 人 CA12 人细胞裂解液 (阳性对照) 4'-乙酰苯并-15-冠-5-(>95.0%(GC))质量规格:>95.0%(GC)4'-Acetylbenzo-15-crown 5-Ether

人胎儿胸腺细胞株;HFT-8810 [HFT8810]1,3-二氨基胍盐酸盐 质量规格:>98%1,3-Diaminoguanidine Monohydrochloride
TNFSF11 Others Mouse 小鼠 RANKL / OPGL / TNFSF11 / CD254 人细胞裂解液 (阳性对照) 十八烷基*基氯化铵质量规格:>99%,BRStearyl Trimethyl Ammoium Chloride(STAC)

小鼠颌下腺上皮细胞完全培养基 100mL十烷基*基氯化铵质量规格:>99%Decyltrimethylammonium chloride

L W-3A小鼠皮下结缔组织细胞 L W-3A mice subcutaneous connective tissue cells DMEM培养基+10%FBS辛基*基氯化铵;八烷基*基氯化铵质量规格:>99%,BRTrimethyloctylammonium chloride

IL1A Protein Mouse 重组小鼠 IL-1 alpha / IL1A / IL1F1 蛋白DMS质量规格:BRDMS

P3X63Ag8.653(小鼠细胞) 5×106cells/瓶×2 L6(大鼠成肌细胞)D-正亮氨酸(>99%,BC)质量规格:>99%,BCD-Norleucine
JAM3 Others Human 人 JAM3 / JAM-C 人细胞裂解液 (阳性对照) Glycogenfromoyster糖元二型1克超,98%

人上皮样细胞;BEAS-2B;γ-丁内酯;4-羌基丁醋内酯 1,4-Butyrolcctonq;1,4-Butcnolidq;1,2-Butcnolidq;γ-xy7noxybutyric ccid lcctonq;4-xy7noxybutyric ccid-γ-lcctonq

HKC细胞,人胚肾上皮细胞 大鼠肺泡巨噬细胞,NR8383细胞 CL-0381MDA-MB-175VII(人导管癌细胞)5×106cells/瓶×22-典本加醋酯 Mqthyl 2-iodobqnzoctq 610-97-9

C918(人眼脉络色素瘤细胞) 5×106cells/瓶×2肌醇5克RT

HWP-c visceral 人类白前脂肪细胞(HWP)内脏 500,000cells 人肠微内皮细胞HIMEC(多聚蛋白胨)
通用探针法荧光定量PCR试剂盒HSC-T6, 大鼠肝星状细胞系3-磺炳基十六烷基二甲甜菜碱3-(N,N-Dimethylpalmitylammonio)propanesulfonate(SHDAB)质量规格:>98%,BR

EB病毒转化的人B细胞(彝族);HYL 人腹膜内皮细胞完全培养基 100mLDBD-ED [=4-(N,N-二甲氨基磺酰)-7-(2-氨基乙基氨基)-2,1,3-苯并恶二唑]DBD-ED [=4-(N,N-Dimethylaminosulfonyl)-7-(2-aminoethylamino)-2,1,3-benzoxadiazole] 质量规格:用于高效液相色谱标记

牛脑垂体提取物BPEAABD-SH (=4-乙酰氨基-7--2,1,3-苯并恶二唑](>94.0%(HPLC))AABD-SH (=4-Acetamido-7-mercapto-2,1,3-benzoxadiazole) 质量规格:>94.0%(HPLC)

EPHB2 Others Mouse 小鼠 EphB2 / Hek5 人细胞裂解液 (阳性对照) 9-(溴甲基)丫啶(>98.0%(HPLC)(T))9-(Bromomethyl)acridine 质量规格:>98.0%(HPLC)(T)

人细胞;SF17DBD-COCl [=4-(N,N-二甲基氨磺酰)-7-(N-氯甲酰甲基-N-甲氨基)-2,1,3-苯并恶二唑](>98.0%(T))DBD-COCl [=4-(N,N-Dimethylaminosulfonyl)-7-(N-chloroformylmethyl-N-methylamino)-2,1,3-benzoxadiazole]质量规格:>98.0%(T)