CXC-受体2在机械应变下促进细胞外基质的产生及副作用

眼压（IOP）是青光眼病理生理学的主要危险因素，不仅影响视网膜神经节细胞（RGCs）的凋亡，还影响视神经乳头（ONH）的生物力学行为。筛板（LC）和视盘周围巩膜（PPS）主要构成ONH复合体，可能对青光眼的发展进展有较大影响。最近的发现引起了人们对高血压巩膜（hypertensive sclera）的生物力学特性的兴趣，并探索了它与青光眼的关系。

细胞外基质（ECM）对于巩膜维持眼压产生的张力很重要。眼压升高可能会增加小鼠巩膜中的纤维成分（如胶原蛋白）并减少非纤维成分。 因此可以推测，高血压性巩膜改变可能表明ECM的合成而不是降解，至少在早期阶段是这样。驻留在巩膜中的细胞的反应是关键点。因此，对巩膜ECM重塑驱动力的机制洞察需要在体外机械应变下对人巩膜成纤维细胞（HSFs），特别是视盘周围HSFs（ppHSFs）进行详细研究。为了研究高血压PPS的ECM重塑，有必要在体外建立适当的ppHSFs应变模型，以模拟体内眼高压。

因此，复旦大学附属眼耳鼻喉科医院、卫生部近视眼重点实验室、上海交通大学医学院附属新华医院骨科等联合团队的一项研究旨在（1）探索ppHSFs在体外合适的双轴机械应变;（2）筛选pHSFs在拉伸应变下的机械刺激基因;（3）研究CXCR2在机械应变下对细胞行为和ECM产生的影响。
多种机械应变下 ppHSFs 的 mRNA 和蛋白表达

为了探索合适的应变参数，在ppHSFs上施加了多个双轴力学应变，幅度分别为：0；5%，0.5Hz；10%，0.5Hz；20%,0.5Hz，持续8h和24h。结果表明，这些基因在不同应变的影响下发生了动态变化。与对照相比，随着机械应变的逐渐加强，I~IV型胶原蛋白、弹性蛋白和聚集蛋白聚糖的mRNA水平呈先升高后下降的趋势，而MMP2、核心蛋白聚糖、纤连蛋白和双糖链蛋白多糖的转录表达显著降低。

多种应变下ppHSFs中I型胶原蛋白和MMP2的蛋白表达与转录水平一致。作为巩膜中的主要成分，I型胶原蛋白占巩膜干重的90%以上。在 5% 0.5 Hz、10% 0.5 Hz、20% 0.5 Hz 应变 8h和 24h下，I型胶原蛋白的折叠变化分别为1.59±0.36、1.62±0.39、0.58±0.13、1.12±0.18、0.90±0.13、1.40±0.36。与近视一样，MMP2也可能在调节眼高压期间的巩膜重塑中起着至关重要的作用。MMP2的相对蛋白水平分别为0.45±0.10、0.60±0.16、0.83±0.17、0.91±0.11、1.17±0.22、0.99±0.19倍变化。

研究表明，高血压巩膜显示纤维成分增加，非纤维成分减少，伴随巩膜硬度增加和巩膜通透性降低。初步实验还证实了大鼠慢性眼高压模型中巩膜I型胶原蛋白和弹性蛋白的产生上调，至少在早期阶段是这样。总之，10% 0.5Hz的应变持续8小时可能是合适的ppHSFs的应变条件，以模仿体内高血压巩膜ECM的产生。

机械刺激和未刺激的 ppHSFs 之间的 RNA 序列和 mRNA 表达谱

接下来比较机械刺激（10% 0.5 Hz，持续8小时）和未刺激的ppHSFs之间的mRNA表达。机械拉伸后转录组发生巨大改变（图1 A）。结果表明，机械刺激触发了促炎细胞因子簇，尤其是CXC配体和受体。因此进一步确认了CXC家族（CXCL1，CXCL2，CXCL3，CXCL5，CXCL12，CXCR2，CXCR5）在应变后哪个差异表达最大（图1 B）。

异常刺激的CXCLs与ppHSFs中的上调CXCR2相结合，然后CXCR2可能将外部机械信号转导为细胞内生物信号，调节下游信号通路，从而启动炎症级联反应并改变细胞行为。此外还进行了蛋白质印迹分析以可视化应变下CXCR2的蛋白表达（图1 C‐D）。因此，CXCR2可能是机械应变下ppHSFs的重要靶点。

为进一步研究CXCR2在ppHSFs中的功能，建立了含有人CXCR2基因shRNA的慢病毒载体。选择shRNA1进行后续实验，因为它在敲低CXCR2方面更有效（图1 E-G）。
机械刺激的CXCR2促使ppHSFs在机械应变下增殖

在10% 0.5 Hz的应变下持续8 h，在ppHSFs中CXCR2的表达上调。然而，CXCR2对ppHSFs的影响尚未得到很好的探索。因此实验检测了细胞增殖能力。与未刺激的对照相比，刺激组中阳性Edu细胞（绿色）的比例增加，表明细胞增殖加快（图2 A、B）。细胞周期分析也显示ppHSFs中的G2和S期显著增加（图2 C、D）。数据还显示，当CXCR2上调时，AKT，STAT3和ERK1/2的磷酸化增加，这可能解释了机械刺激的细胞增殖（图2 E、F）。免疫荧光成像显示磷酸化的STAT3在相同情况下发生细胞核易位（图2 G）。当CXCR2表达被shRNA敲低时，两组之间的Edu成像没有显著变化。因此，CXCR2可能在机械应变下促进ppHSFs的细胞增殖。
 
机械刺激的 CXCR2 通过 Jak1/2‐STAT3 信号通路在机械应变下增加了 ppHSFs 中巩膜 ECM 的产生

为了探讨CXCR2对巩膜ECM的mRNA和蛋白质产生的影响，进行了qPCR和蛋白质印迹。结果表明，应变刺激的CXCR2上调增加了I型胶原蛋白的mRNA和蛋白质产生，减少了siRNA对照组中MMP2的产生。当CXCR2表达受到抑制时，机械刺激后I型胶原蛋白和MMP2的mRNA和蛋白质产生被逆转（图3 A-C）。CXCR2还可以调节I型胶原蛋白的分泌水平和MMP2的活性。当CXCR3被敲低时，应变下磷酸化的STAT2的易位也减弱（图3 D、E）。

通过应用JAK2/3抑制剂芦可替尼也可以消除应变下I型胶原蛋白的增加，MMP1的减少和STAT2磷酸化的激活。因此，可以推测，机械刺激的CXCR2可能通过JAK1 / 2-STAT3信号通路调节ppHSFs中巩膜ECM的产生。
CXCR2对ppHSFs细胞凋亡的影响

采用膜联蛋白V/PI双重染色的流式细胞术分析细胞凋亡情况。结果表明，ppHSFs的凋亡在应变下略有降低，但无统计学意义。在shRNA干扰组中，应变后CXCR2的表达受到抑制，凋亡细胞明显减少。结果表明，抑制 CXCR2可能降低ppHSFs的凋亡。

机械刺激的CXCR2通过FAK/MLC2通路减弱了机械应变下ppHSFs的细胞迁移

对于细胞迁移率，进行迁移测定。在siRNA对照组中，在有或无应变条件下，ppHSFs在划痕后24h的迁移量分别占总迁移量的38.65% 和 59.16%。在shRNA组中，在有或无应变条件下，细胞的迁移量分别占总迁移量的 34.06% 和 37.12%（图4 A、B）。在机械应变作用下，CXCR2的上调增加了磷酸化的FAK，但抑制了磷酸化的MLC2，从而降低了ppHSFs的迁移能力。然而，当CXCR2被敲低时，FAK和MLC2的磷酸化在应变后没有显著变化（图4 C、D）。因此，CXCR2可能会影响ppHSFs在机械应变下的迁移能力。

此外，还应用了FAK抑制剂和DMSO。在对照（DMSO）组中，细胞迁移在机械应变下减慢。FAK的磷酸化上调，MLC2的磷酸化下调，与CXCR2 siRNA对照组的结果一致。然而，细胞迁移和MLC2的磷酸化在应用FAK抑制剂后恢复。总之，CXCR2可能通过FAK/MLC2信号通路抑制ppHSFs在应变下的迁移。
综上所述，该研究表明，10% 0.5 Hz 持续 8 小时的应变可能是 ppHSFs 重现体内高血压巩膜重塑的适当条件。在这种机械应变下，ppHSFs可能会经历复杂的炎症过程，至少在早期是这样。上调的CXCR2可以促进细胞增殖，通过JAK1/2-STAT3信号通路调节I型胶原和基质金属蛋白酶2的mRNA和蛋白表达，并通过FAK/MLC2通路抑制细胞迁移。机械转导的机制可能值得进一步研究，包括microRNA等作用。机械应变可能诱导细胞microRNA的显著变化，这表明microRNA可能是在机械刺激下调节ppHSFs的机制之一。总之，从巩膜疗法的角度来看，CXCR2可能是青光眼的潜在治疗靶点。

参考文献：Qiu C, Wang C, Sun X, Xu J, Wu J, Zhang R, Li G, Xue K, Zhang X, Qian S. CXC- receptor 2 promotes extracellular matrix production and attenuates migration in peripapillary human scleral fibroblasts under mechanical strain. J Cell Mol Med. 2022 Dec;26(23):5858-5871. doi: 10.1111/jcmm.17609. Epub 2022 Nov 8. PMID: 36349481; PMCID: PMC9716229.
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36349481/

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