基于pHLA的免疫治疗平台直接调节抗原特异性T细胞

抗原特异性(AgS)T细胞的靶向药物激活可能绕过当前基于T细胞的癌症治疗固有的限制。这里两个免疫治疗平台，用于选择性地将共刺激配体和多肽-HLA(pHLA)输送到AgS T细胞。在这些平台上设计和部署了一种亲和力减弱的IL-2变体，它在体外选择性地扩增寡克隆和多功能的AgS T细胞，并与CD80信号协同作用，实现优于多肽刺激的增殖。

过继T细胞疗法(ACT)已显示出令人印象深刻的临床结果，使用患者来源的T细胞体外激活与有效的T细胞受体(TCR)。然而，由于复杂的制造和回输要求、患者调理方案和安全考虑，细胞疗法接触到的患者较少。相比之下，系统共刺激代表了癌症免疫治疗的一种可扩展的药理学方法，其目的是在患者体内直接激活和扩大肿瘤特异性T细胞。然而，试图用抗CD137抗体和大剂量IL-2等药物通过全身激动剂诱导抗肿瘤T细胞反应的尝试与显著的毒性风险相关。IL-2细胞因子，能够诱导CD8效应T细胞(Teff)以及其他具有抗肿瘤潜力的T、B和NK细胞系的增殖和分化。在转移性肾细胞癌和恶性黑色素瘤的情况下，大剂量的IL-2可以在少数患者中诱导治愈缓解，与AgS Teff水平升高相关，但剂量受到严重和潜在威胁生命的毒性的限制，如血管泄漏综合征和细胞因子释放综合征。IL-2的抗肿瘤作用还受到调节性T细胞(Treg)的间接限制，由于高水平表达高亲和力的IL-2受体，Treg在体内有效地扩增为IL-2。Treg计数升高，可以限制Teff反应，与癌症患者预后不良有关。此外，针对不同的共刺激途径的癌症免疫治疗组合具有极大地放大T细胞反应的潜力。然而，在转移性黑色素瘤的治疗中，CTLA-4和PD-1通路的联合抑制表明，毒性也可能是复合的，限制了它们的实用性。IL-2和其他共刺激剂在癌症中的更广泛治疗应用可能需要将它们的作用集中在那些能够提供最大治疗效果的T细胞上，特别是癌症AgS T细胞。

癌症疫苗代表了癌症免疫治疗的另一种可扩展的药理学方法。然而，疫苗的效力取决于抗原提呈细胞(APC)的功能，包括运输、抗原处理、共刺激与共抑制以及对肿瘤免疫抑制的敏感性。例如，DC是一种APC，通过递送pHLA和强大的共刺激配体如CD80、CD86和CD137L，在启动和维持抗肿瘤CD8 T细胞应答中发挥关键作用。然而，DC也富含抑制配体，如TIM-3、PD-L1、PD-L2、HVEM、B7-H3、B7-H4、IL-T3和IL-4，它们削弱了T细胞的反应，并受到局部和远端肿瘤的影响。因此，需要安全、可扩展和APC非依赖的免疫疗法，以使抗肿瘤T细胞激活和相关的肿瘤细胞杀伤达到临床有效水平。基于控制T细胞功能的天然信号，已经确定了这一挑战的潜在解决方案：pHLA和共刺激配体，体现在Immuno-STAT (T细胞的选择性靶向和改变)和Neo-STAT免疫治疗平台中。Immuno-STAT和Neo-STAT利用紧凑的、基于Fc的架构，适合临床制造，旨在将针对强大的共刺激剂(如IL-2)的优化信号直接聚焦到体内的AgS T细胞，从而增强抗肿瘤T细胞反应，同时避免不分青红皂白的免疫激活。

Immuno-STAT框架包括多肽表位、MHC I类等位基因、共调节剂和Fc的共价融合，赋予亲和力和对称的多价性，足以激活同源T细胞(图1a)。潜在的共调节剂、共刺激和共抑制配体可以融合到MHC-Fc重链的N-或C-端或β2m的C-端，从而允许组织、组成和化学计量的灵活性。对Immuno-STAT平台的初步探索利用IL-2作为共调节剂来激活和扩增AgS细胞毒效应T细胞(Teff)。

图1  Immuno-STAT的设计、优化和活性。

为了确定优化的基于IL-2的Immuno-STAT框架，评估了一组构建体的相对效力、AgS选择性和可制造性。构建体由LCMV gp33-41/H-2Db组成，由小鼠TCR P14识别，在其N端与人IL-2的变体融合，并在C端与效应减弱的小鼠IgG2a Fc融合。包括IL-2减弱突变，以限制IL-2Rα依赖的毒性和Treg结合，以及降低IL-2亲和力，有利于pMHC选择性。基于可制造性IL-2化学计量比被限制为两个或四个，这表明蛋白质滴度显著下降超过四个拷贝的IL-2(图S2)。人IL-2在人和小鼠细胞上都显示出很强的活性，包括IL-2R近端信号分子STAT5的磷酸化，以及磷酸化的STAT5(pSTAT5)作为IL-2R参与的一个指标，它与IL-2R激动剂的下游后果（如增殖和表型标志物的表达）有很好的相关性。比较了pSTAT5对来自AgS P14 TCR转基因小鼠和非AgS C57BL/6小鼠的纯化CD8脾细胞的诱导作用，并根据logEC50-P14(效力指数)、P14减去EC50-P14上的C57BL/6信号(选择性指数)和蛋白质表达滴度对构建的结构进行了排序(图S3)。构建的LCMV-IST-IL2.FH4最高，其次是LCMV-IST-IL2.F4。在这个初始筛选中，对排名靠前的候选LCMV-IST-IL2.FH4和LCMV-IST-IL2.F4的剂量反应进行了重新评估，得到了更宽的浓度范围和更高的分辨率(图1b)。P14脾细胞pSTAT5-EC50的对数(LogEC50-P14)表明，LCMV-IST-IL2.FH4、LCMV-IST-IL2.F4、LCMV-IST-IL2.2和LCMV-IST-IL2.4之间的AgS效力没有显著差异。同样，非AgS效力(LogEC50-B6)对于这些结构也是相似的。AgS的选择性首先通过AGS(P14)脾细胞EC50-P14处的标准化pSTAT5信号(即50%)相对于非AgS(C57BL/6)脾细胞的差异以及AgS与非AgS脾细胞的logEC50的差异来衡量。两种AgS选择性的测量在构建LCMV-IST-IL2.FH4、LCMV-IST-IL2.F4、LCMV-IST-IL2.2和LCMV-IST-IL2.4之间没有显著差异。因此，相对于携带两个或四个野生型IL-2拷贝的参考构建体(LCMV-IST-IL2.2或LCMV-IST-IL2.4)，没有观察到F42A和H16A介导的IL-2R信号效力或选择性的显著降低，推测部分地被增加的IL-2化学计量比所掩盖。

图S2 随着IL-2化学计量比的增加，Immuno-STAT蛋白表达减少

图S3

接下来，测试了携带IL2.FH4、效应减毒的人IgG1、HLA-A*0201和模型表位CMV pp65(495-503)或MART1(26-35)的人源化Immuno-STAT信息(图1c)。对于多个供体，测定了人PBMC与特定的IST-IL2.FH4孵育10天后双四聚体阳性的AgS CD8 T细胞的频率(图1d)。CMV-IST-IL2.FH4，而不是CMV-IST(无IL-2融合)能够从PBMC扩增CMV特异性CD8T细胞，表明其增殖依赖于IL2.FH4的存在。同样，CMV-IST在存在但并非不存在重组人IL-2(野生型)扩增的CMV特异性CD8 T细胞的情况下，进一步支持了IL-2R激动剂对免疫调节活性的要求。CMV-IST-IL2.FH4或MART-IST-IL2.FH4对PBMC CD8T细胞的高峰扩增(＞30倍)相似(图1e)。此外，在相似的Immuno-STAT浓度下，PBMC CD8 T细胞对CMV-IST-IL2.FH4或MART-IST-IL2.FH4的反应达到了高峰扩增。然而，在扩大培养和培养基中，CMV特异性频率比MART特异性高。细胞因子IFN-γ、TNF-α、颗粒酶B和膜蛋白CD107a是表型标记物，它们在多种情况下由淋巴细胞联合表达与细胞毒功能有关，包括临床上有效的抗肿瘤反应。Immuno-STAT和肽扩增的AgS CD8 T细胞中有很大一部分表达IFN-γ、TNF-α、颗粒酶B和CD107a，以响应同源肽的攻击(图1f)。对于IFN-γ、TNF-α和CD107a，对无关多肽的反应可以忽略不计。在测量的所有浓度下，颗粒酶B对无关多肽的反应高于零，但一般低于对同源多肽的反应。重要的是，Immuno-STAT扩增的AgS CD8 T细胞同时表达多个这些表型标记，类似于肽扩增的AgS CD8 T细胞，与强大的Teff群体的分化一致(图1f)。表达IFN-γ、TNF-α、颗粒酶B和CD107a的Immuno-STAT和多肽扩增的AgS CD8 T细胞的剂量反应也相似。与稳健的Teff谱系一致，从多肽或Immuno-STAT扩增中分离的单细胞四聚体显示了类似的TCRαβ寡克隆频率分布，并且在IST和多肽扩增的CMV-的亚群之间观察到了序列一致性，但没有观察到MART反应克隆，这主要是低克隆(图1g)。

模块化Immuno-STAT框架与多种共调节剂、多肽和HLA等位基因兼容。例如，IL-2、CD80、CD86和CD137L是CD8 T细胞的有效共刺激配体，其变体可以整合到Immuno-STAT框架中。此外，除了HLA-A*0201相关多肽，AFP(403-411)/HLA-A*1101和HBVp109-118/HLA-A*2402分别具有良好的特性，癌症和传染病抗原在没有共调节器的Immuno-STAT框架上表达良好(即，仅pHLA)。在这里，Immuno-STAT pHLA的表达可以很好地预测Immuno-STAT组合的表达，例如Immuno-STAT-IL2.FH4。然而，与HLA结合较弱的表位通常更难表达，包括具有临床意义的癌症表位，如KRAS G12D(图2a和表1)。因此，开发了Neo-STAT，它使用肽的特定位点化学结合到稳定工程的“空”HLA，从而能够呈现低亲和力的肽和不能通过基因融合获得的部分(图2b)。CMV pp65(495-503)和MART1(26-35)是先前在Immuno-STAT框架上探索的模型表位，它们成功地连接到带有IL2.FH4的Neo-STAT框架上的空HLA-A*0201(即NST-IL2.FH4)。CMV-NST-IL2.FH4选择性扩增CMV特异性T细胞，效力与CMV-IST-IL2.FH4相似(图2c)。接下来，作为对共调节器灵活性和组合共调潜力的初步探索，评估了携带CD80胞外区的CMV-IST(CMV-IST-CD80-2)在体外诱导抗原特异性增殖的能力，无论是作为单一药物还是与CMV-IST-IL2.FH4联合使用。虽然CMV-IST-CD80-2单独使用不能诱导AgS高于本底水平的增殖，但CMV-IST-CD80-2与CMV-IST-IL2.FH4在体外扩增CMV特异性T细胞方面显示出协同作用，并且其水平优于肽刺激(图2d)。

图2  Immuno-STAT和Neo-STAT表位与共调节灵活性

表1  IST-IL2.FH4框架上可表达表位和非表达表位与HLA-A*0201的亲和性

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