摘要:通过MTT法可以得到细胞的生长曲线,也可对瞬时转染后的细胞进行检测,本文主要介绍了MTT的作用原理及实验操作要点。
MTT全称3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名为:噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT主要有两个作用:① 药物(或其他处理方式如放射线照射)对体外培养的细胞毒性的测定(如 细胞瞬时转染表达后可对细胞进行MTT检测)② 用于细胞增殖及细胞活性的测定,可以制得细胞生长曲线。
MTT法检测细胞存活和生长的主要机理是:活细胞中的某些物质(线粒体中的琥珀酸脱氢酶)能够和MTT反应,使MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(图1)并沉积在细胞中,而死细胞没有此功能。DMSO(二甲基亚砜)能够将此结晶(蓝紫色甲瓒)溶解,在酶联免疫检测仪490nm波长处测定其吸光值,能够间接的反应活细胞的数量。一定范围内,蓝紫色结晶沉淀的数量与细胞数成正比。目前MTT法因其灵敏度高,经济快速等优势被广泛的运用于细胞毒性试验,肿瘤药物的筛选、放射敏感性测定和对某些生物活性因子的活性检测等方面。MTT法也有自身的缺点,如MTT检测生产的蓝紫色产物(甲瓒)不溶于水,需被溶解后才能检测。一方面使得工作量增加,另一方面对实验结果的准确性产生一定的影响,且用于溶解甲瓒的有机溶剂对人体有一定的危害。细胞瞬时转染表达后的细胞也可做MTT实验,多数人不知道是先转染再做 MTT,还是先做MTT再进行瞬时转染,这里建议是先做转染,培养一段时间后(24/48h),重新接种至96孔板,加药两天左右,再进行MTT检测。
水不溶性的蓝紫色甲瓒
在进行实验时,由于实验作用时间较短,因此可不避光,但是要将超净台的日光灯关掉,效果会更好。
绘制结果应当如图2所示,呈现S形。与细胞培养计数法获得的生长曲线接近。前三天左右为停滞期,随后细胞进入对数生长期,最后进入稳定生长时期。
因为在相同体积内细胞数与吸光度成正比,所以在对数生长时期,曲线越倾斜(斜率越大),细胞的群体倍增时间越短。
图2 MTT法实验结果
利用细胞计数法也可以绘制生长曲线,具体的实验操作及结果分析方法请查看: 细胞计数法绘制生长曲线
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