一、PCR 的基本原理 类似于 DNA 的体内复制。首先待扩增 DNA 模板加热变性解链,随之将反应混合物冷却至某一温度,这一温度可使引物与它的靶序列发生退火,再将温度升高使退火引物在 DNA 聚合酶作用下得以延伸。这种热变性 - 复性 - 延伸的过程就是一个 PCR 循环,PCR 就是在合适条件下的这种循环的不断重复。 二、PCR 反应体系 1. 缓冲液 标准的缓冲液含 1pmol/ml Tris ·HCl,其 pH 为 8.3-9.0(室温),而在延伸温度(72 ℃)下,pH 值接近 7.2 。缓冲液中含有一种二价阳离子,用于激活 DNA 聚合酶的活性中心,一般使用 Mg2+。 2.dNTP 脱氧核糖核苷三磷酸的缩写,是包括 dATP, dGTP, dTTP, dCTP 等在内的统称,即合成新的 DNA 链的材料。4 种 dNTP 的浓度相等,总浓度一般为 200pmol/ml (即饱和浓度)。dNTP 可与 Mg2+ 结合,使游离的 Mg2+ 浓度下降,影响 DNA 聚合酶的活性。 3. 引物 引物是一段短的单链 DNA 片段,可结合在核酸链上与之互补的区域,其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点,DNA 聚合酶可由其 3′端开始合成新的核酸链。引物长度一般以 18~30bp 为宜,过短则降低特异性,过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增,同时也增加引物合成的成本。引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。 4. 模板 模板是一段单链或者双链 DNA,提供用于进行 PCR 扩增的原始信息。对模板的纯度要求低,但不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA 聚合酶抑制剂、DNA 结合蛋白等。模板 DNA 应该尽量保持低温保存。 5.Taq DNA 聚合酶 Taq DNA 聚合酶以 DNA 为复制模板,从将 DNA 由 5' 端点开始复制到 3' 端的酶。DNA 聚合酶的主要活性是催化 DNA 的合成(在具备模板、引物、dNTP 等的情况下)及其相辅的活性。必须一直保存于-20℃,内含甘油保存。最适反应温度 72 ℃,即延伸温度。通常在配制 PCR 体系的最后加入。
三、PCR 操作流程及注意事项 1. 试剂准备阶段 试剂准备是 PCR 操作的第一个流程,需要在试剂贮存和准备区的超净工作台或生物安全柜进行,用确保无污染的移液器、枪头及容器等进行分装。所有的 PCR 体系都应该在 - 20℃ 保存,除了 ddH2O 之外,其余的试剂组份需完全融化之后再加入,以免影响浓度。配制反应体系应在快速进行,以减少非特异性扩增。体系配制完成之后应马上进行 PCR 反应。 2. 样本制备阶段 样本制备是整个 PCR 反应中最为关键的环节,在接收样本时一定要确保样本的密封性以及样本编号的唯一性。严格遵守操作规程进行加样操作,操作时候尽量少说话或者不说话。 所有操作需要在生物安全柜内进行,操作前后生物安全柜需要进行紫外灯消毒,注意生物安全柜中物品的排放。戴手套并勤于更换,要有「无核酸观念」 。 3. 核酸扩增 在核酸扩增环节需要选择质量好的 Ep 管,装入反应体系的 EP 管上机前混匀、离心,将管壁及管盖上的液体甩至管底部。在样本检测的同时设立对照(阳性对照、阴性对照、阴性模板、试剂对照)。同时严密检测 PCR 扩增仪的各项性能指标,其中对 PCR 扩增仪而言温度控制就意味着质量。 4. 产物分析 常见问题: 1)无 CT 值出现:模板量不足(杂质的引入及反复冻融的情况等) 2)CT 值出现过晚(大于 38):各种反应成分的降解或加样量的不足 3)标准曲线线性相关性不佳:加样误差、标准品出现降解等 4)阴性对照有信号:模板有基因组的污染 5)扩增效率低:反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解、反应抑制 6)扩增曲线的异常:模板的浓度太高或荧光染料的降解 四、实验室操作环境的维护 1) 各工作区要有一定的隔离,进入工作区域应按照单一的方向进行。试剂贮存和准备区 → 标本制备区 → PCR 扩增区 → 产物分析区单一方向进行。 2) 各个区域实验用品专用:各个区域实验设备和物品应有明确的标记,不能混用。 3) 实验场所要保持通风良好,严格监测各个工作区的温湿度。 4)注意实验室污染的预防。 整个 PCR 实验的操作都需要特别注意避免污染,来自样本的、试剂的以及实验室各种气溶胶,要始终保持「无核酸观念」。 题图来源:站酷海洛 Plus |
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