北京高中生物：PCR技术应用之一---基因定点突变的原理

PCR技术是一项很强大的技术手段，当然也是考试的重点了。今天重点说一下PCR技术应用之一：OverlapPCR技术---基因定点突变

1. 基因定点突变：将某基因中的一个或者几个碱基替换（补充说明也可以增加或者缺失碱基对）成其它碱基，导致基因中的部分碱基序列发生改变（也就是我们说的遗传信息发生改变），实现基因的定点突变。

2. 回顾一下强大的PCR技术原理：

结论：

 通过上图可以发现，只要设计出DNA上某一段片段（本图也就是蓝色的目的基因片段）两侧的一对方向相反的引物，那么这一对引物，所夹的那段（本图就是目的基因）经过至少三轮的DNA复制（扩增）就会得到中间的那段目的基因。

3.应用OverlapPCR技术：如下图,采用具有互补末端的引物(b与c两个引物互补），使PCR的产物形成一段重叠链，然后通过重叠部分的延伸，将来源不同的扩增片段重叠拼接的技术。

4.使用OverlapPCR技术使基因的定点突变。

大概的过程：

（1）首先在需要突变的位点设计一个突变的引物对，这对引物对于基因来说位于中央位置，如上图的Fm和Rm，带红色标记的是替换成别的碱基，比如正常是C可以换成T等方法，当然Fm和Rm位于突变区域的相同位置而且需要反向互补，能够进行碱基互补配对。同时还应设计他们对应的引物，也就是基因两端的，像上图的F和R引物。

（2）设计好上述的引物：第一轮PCR---分别R和Fm，F和Rm为引物对扩增(也可以分两次做PCR），根据我上面说的PCR的结论就可以得到左右两部分的DNA片段，关键会出现相同也就是一样的一段---突变位点那部分；

（3）扩增完成后的产物同时为模板进行下一轮的PCR，因为突变位点俩区域可以碱基互补配对而连接起来，这样可以将来源不同的扩增片段重叠拼接起来，然后引物的作用下延伸，最后在引物R和F扩增出大量的突变基因。这样可能还是有点模糊和疑问。

4.为此生物颂100的小崔老师专门找到了北京市海淀区（2018年期中）考过一个相关的的题，可以应用一下。

练习.（2018海淀期中，34）萝卜的蛋白A具有广泛的抗植物病菌作用，而且对人体没有影响。我国科学家欲获得高效表达蛋白A的转基因大肠杆菌作为微生物农药，做了相关研究。

（1）研究者用相同的_________酶处理蛋白A基因和pET质粒，得到重组质粒，再将重组质粒置于经_________处理的大肠杆菌细胞悬液中，获得转基因大肠杆菌。

（2）检测发现，转入的蛋白A基因在大肠杆菌细胞中表达效率很低，研究者推测不同生物对密码子具有不同的偏好，因而设计了与蛋白A基因结合的两对引物（引物B和C中都替换了一个碱基），并按图2方式依次进行4次PCR扩增，以得到新的蛋白A基因。

①这是一种定点的_________技术。

②图2所示的4次PCR应该分别如何选择图1中所示的引物？请填写以下表格（若选用该引物划“√”，若不选用该引物则划“×”）。

引物A

引物B

引物C

引物D

PCR1

PCR2

PCR3

PCR4

（3）研究者进一步将含有新蛋白A基因的重组质粒和_________分别导入大肠杆菌，提取培养液中的蛋白质，用_________方法检测并比较三组受体菌蛋白A的表达产物，判断新蛋白A基因表达效率是否提高。为检测表达产物的生物活性，研究者将上述各组表达产物加入到长满了植物病菌的培养基上，培养一段时间后，比较_________的大小，以确定表达产物的生物活性大小。

（4）作为微生物农药，使用时常喷洒蛋白A基因的发酵产物而不是转蛋白A基因的大肠杆菌，其优点是_________。

 本题答案：

（1）限制酶和DNA连接    CaCl2

（2）①基因突变

②如下表所示。注：正确填写PCR1、PCR2、PCR3、PCR4的引物组合之一，每填对一个得1分。共4分。

引物A

引物B

引物C

引物D

PCR1

√

√

×

×

PCR2

×

×

√

√

PCR3

×

×

×

×

PCR4

√

×

×

√

（3）含有蛋白A基因的重组质粒、空质粒（pET质粒）  抗原-抗体杂交   抑菌圈

（4）对人、畜、农作物和自然环境安全；不会造成基因污染；有效成分纯度较高。（答对一点或其他合理答案均可得分）

通过这道题，你对PCR定点突变的应用应该有了更深一层的认识，如果还是有疑问可以查阅相关资料或者加我微信18310709058我们一起探讨一下。PCR技术还有很多应用：如检测基因型，分子克隆，基因敲除等，被广泛应用于基础研究、疾病诊断、农业检测和法医调查等领域。

备注：小编能力有限，如有不足之处，希望批评指正，信息仅供参考学习。

参考资料：

1.黄立华，梁山，谷峻等著 。《分子生物学实验技术》，科学出版社。

2.http://pic.sogou.com/pics?query=pcr%B6%A8%B5%E3%CD%BB%B1%E4%CA%BE%D2%E2%CD%BC&p=40230500&st=255&mode=255&policyType=0；

3.https://baike.sogou.com/v483259.htm?fromTitle=%E5%AE%9A%E7%82%B9%E7%AA%81%E5%8F%98

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　备注：信息仅供参考学习，如有不足望批评指正。