重磅！环状RNA研究实验流程详解

2016年初陈玲玲与杨力教授曾在Springer出版集团新出的一本实验方法书《Long Non-Coding RNAs Methods and Protocols》中撰文介绍环状RNA的研究方法(Zhang et al., 2016)，应众多读者的需求，山人针对该操作方法做详细的解读：

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总体而言，要进行全转录组中环状RNA的分析，需要分三步走：1. RNA样品收集；2. RNA样品预处理；3. 测序及验证分析。

图1 环状RNA分析常规实验流程（来自(Zhang et al., 2016)）

环状RNA分析的样品如何制备和预处理？

首先需要制备去除核糖体RNA，再进一步制备不含Poly-A的RNA样品。主要使用Invitrogen的核糖体RNA去除试剂盒：RiboMinus™ Human/Mouse Transc riptome Isolation Kit（货号K1550-01）进行制备工作。进一步通过磁珠法结合Poly (A)的RNA后剩余的RNA即为Poly (A)- RNA样品。

图2 去除核糖体RNA及不含Poly(A)的RNA制备流程（来自(Yin et al., 2015)）

然后进行RNase R消化：获得的RNA样品用52μL DEPC水重悬，一分为二，其中一份进行RNase R消化，另一份做对照。RNase R消化组加3μL 10×RNase R Reaction Buffer，1μL RNase R (20 U/μl)，（不消化的组加1μLDEPC水），37 °C for 1–2 h。消化结束后加30μL 酚-氯仿-异戊醇，震荡混匀以终止消化，13000× g， 4 °C 离心 5 min。弃上清，沉淀用6μL 4 M氯化锂，1μL糖原，90μL预冷无水乙醇颠倒重悬，−80 °C沉淀1h，也可以直接放置在−80 °C，直到准备下一步实验时。实验前用13000× g， 4 °C 离心 20 min，用75%预冷乙醇洗涤两次，风干后20μLDEPC水溶解即可用于下一步的实验。

PS：RNase R消化时间比较重要，时间太短容易导致部分线性的RNA没法彻底消化干净，而时间过长又有可能导致部分RNase R敏感的环状RNA损失。作者根据经验，推荐用于Nothern杂交的样品处理1h足够了。此外，不同来源的RNase R的活力单位也需要注意。

环状RNA样品进行测序分析的主要流程

上述获得的RNA样品可直接用于RNA-seq的建库分析。关于仅包含内含子序列的ciRA以及反向拼接（back-spliced）的circRNA的分析主要通过测序Reads的mapping结果进行分析，后面我们将专门针对环状RNA二代测序数据分析技术进行一次专题介绍，敬请关注。

如何进行环状RNA的Northern杂交分析实验？

首先制备尿素-丙烯酰胺变性胶，2×尿素上样Buffer预混RNA样品（总体积小于10μL），100℃煮沸5min充分变性，迅速置冰上。点样，1×TBE电泳液体系120 V电压电泳3 h。1×转膜液转膜至尼龙膜上，100V转膜90min。254nm紫外180 mJ/cm2交联。

探针制备：利用RiboMAX™ Large Scale RNA Production Systems（Promega）试剂盒进行探针制备，概括而言步骤包括将DNA模板，10×Dig labeling mixture，5×转录Buffer，T7或SP6转录酶与DEPC水混合好（具体体系依据说明书），37 °C反应 2–3 h。1μL DNase I 37°C反应15min消化DNA模板。RNA探针通过氯化锂-乙醇体系沉淀浓缩（4μL 4M氯化锂，100μLDEPC水，300μL预冷无水乙醇，颠倒混匀，−20 °C 沉淀1 h）。继续用预冷75%乙醇洗涤两次，晾干后用40μL DEPC水重悬。

杂交实验：先用DIG Easy Hyb (3 ml/100 cm2 ) 68 °C预杂交30 min，缓慢摇动。探针变性：100 °C处理5min后迅速置冰上。DIG Easy Hyb混合RNA探针 (100 ng/mL)，孵育过夜，轻轻摇动。洗涤：2×SSC, 0.1 % SDS，5min洗两次，0.2×SSC, 0.1 % SDS 68 °C，30min洗两次。1×Washing buffer漂洗一下，在1×Blocking solution中封闭30min，抗体孵育30min，1× Washing buffer 20min洗3次，Detection buffer 孵育5 min，加 CDP- Star ready-to-use solution （100 cm 2膜加 1ml)，孵育2-5min。压片显影。

PS：尿素变性电泳往往用于检测小于500nt的RNA分子。环状RNA的特殊结构导致在该体系中泳动速度远低于同样大小的线性RNA。

如何进行环状RNA的反转录PCR鉴定实验？

RNase R消化后的RNA样品利用随机引物反转录后可以直接用于定量PCR等分析。还可以基于RNA-seq或数据库检索中初步获得环状RNA的环化位点，专门设计针对特定环状RNA（某环化位点或外显子序列）的反转录和QPCR检测体系。后面我们将专门针对环状RNA反转录及定量PCR分析技术进行一次专题介绍，敬请关注。

环状RNA分析需要准备哪些试剂？

Rnase R：Epicentre，货号RNR07250

酚-氯仿-异戊醇（体积比25:24:1）：Life Technology，货号15593-031

4 M 氯化锂：称取3.3912 g 氯化锂（Sigma，货号L9650-500 G）于15ml RNase-Free的离心管中，加10 mlDEPC水溶解，充分溶解后用0.22μm孔径的Millex-GP 针头滤器过滤，分装，-20°C保存。

糖原（RNA级）：Thermo，货号R0551

75 %乙醇：无水乙醇用DEPC水稀释至75%体积比浓度，-20°C保存。

尿素：AMRESCO，货号037-1 KG

30%丙烯酰胺：Sangon Biotech，货号SD6017

10×TBE电泳Buffer：108 g Tris base（Sigma，货号15456-3），55 g 硼酸（Sigma，货号B6768-500 G)，40ml 0.5M EDTA（pH8.0），加DEPC水定容至1L。0.22μm孔径的Millex-GP滤器过滤，室温保存。使用时用DEPC水稀释至1×

0.5 M EDTA, pH 8.0：186.1 g Na2 EDTA • 2H2 O（(Sigma，货号E5134-250 G)，500mL DEPC水溶解，用NaOH调pH至8.0，DEPC水定容至1L，0.22μm孔径的Millex-GP滤器过滤，室温保存。

10 % (w/v) 过硫酸铵： 0.1 g 过硫酸铵（Sigma，货号A3678-25 G）溶解至1mLDEPC水中，4 °C保存。

TEMED：BIORED，货号161-0801

2×尿素上样Buffer：8M尿素，90%甲酰胺（Sigma，货号F9037-100 mL），20 mM EDTA，0.1 % (w/v) 二甲苯青, 溴酚蓝。4 °C保存。

50×转膜Buffer：30.285g Tris碱，17.02 g 三水合乙酸钠（Sigma，货号236500-500 G）， 9.306 g EDTA，10mL乙酸，溶解于500mL DEPC水中，0.22μm孔径的Millex-GP滤器过滤，室温保存。使用时用DEPC水溶解至1×

RiboMAX™ Large Scale RNA Production Systems：Promega，货号P1280 (SP6), P1300 (T7) 用于合成RNA探针。

Dig RNA Labeling Mix：Roche，货号11277073910

DNA-free™ Kit, DNase Treatment and Removal Reagents：Ambion，货号AM1906

Dig Easy Hyb Granules：Roche，货号11796895001，

20× SSC:175 g NaCl（Sigma，货号S9625-1 KG），88 g柠檬酸钠二水合物(Sigma，货号W302600)，500mL DEPC水，调pH至7.0，DEPC水定容至1L。0.22μm孔径的Millex-GP滤器过滤，室温保存。2×SSC和0.2×SSC用DEPC水稀释获得。

10 % (w/v) SDS：100 g SDS (Sigma，货号L3771-1KG) 用1L DEPC水溶解，0.22μm孔径的Millex-GP滤器过滤，室温保存。0.1 % SDS 用DEPC水稀释获得。

DIG Wash and Block Buffer Set：Roche，货号11585762001

Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments：Roche，货号11093274910

CDP- Star , ready-to-use solution：Roche，货号12041677001

Supersc ript™ III Reverse Transc riptase反转录酶：Invitrogen，货号18080

Random hexamers随机引物：TaKaRa，货号RR037A

dNTP：TaKaRa，货号T4030

Recombinant RNasin ® Ribonuclease Inhibitor：Promega，货号N2511

参考文献：

Yin, Q.F., Chen, L.L., and Yang, L. (2015). Fractionation of non-polyadenylated and ribosomal-free RNAs from mammalian cells. Methods Mol Biol 1206, 69-80.

Zhang, Y., Yang, L., and Chen, L.L. (2016). Characterization of Circular RNAs. Methods Mol Biol 1402, 215-227.

文 | circRNA 吉赛生物

本文为作者授权肽度时界发布

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