一文get TaqMan探针法实时荧光定量PCR技术

在PCR反应体系中加入荧光化学物质，利用荧光信号积累实时定量检测致病病原体基因核酸，该技术为实时荧光定量PCR（简称qPCR）。它比化学发光、时间分辨、蛋白芯片等免疫学方法更具独到优势。

根据所用荧光化学物质的不同，qPCR可分为荧光染料法（SYBR Green Ⅰ 法为代表）和荧光探针法（TaqMan法为代表）。

SYBR Green Ⅰ 染料法因具有使用简便，价格便宜等优点而被广泛使用。但其最大的缺点是缺乏特异性，即染料可以与任何dsDNA结合。因此，qPCR反应中有非特异性扩增产物的出现会增加荧光值，影响定量结果的准确性，而TaqMan探针法的出现很好地解决了染料法非特异性的问题。

TaqMan探针法荧光定量PCR已被广泛地应用于科学研究和生产实践之中。有基础生物学研究、食品检测、医学检测与诊断等，尤其是在医学检测和诊断方面得到了大力地推广。

那么从检测原理上看

TaqMan探针法qPCR技术

如何做到更胜一筹呢

一起来瞧瞧

常规PCR技术

对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析

无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测

实时定量PCR技术

利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析

重复性好、特异性强、线性范围宽

图 1 Probe示意图

TaqMan法qPCR原理概述

Probe为水解型杂交探针，序列与目标序列互补

5’端标记有荧光报告基团（Reporter, R），如HEX、FAM、ROX、JOE、VIC等

3’端标记有荧光淬灭基团（Quencher, Q）

探针完整时，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光

Taq酶有5’→3’外切核酸酶活性，可水解探针，R与Q分开，发荧光

图 2 TaqMan 水解探针作用机理图（图源于网络，侵删）

过程原理解析

PCR扩增时，将一对引物、特异性的TaqMan探针（5’端标记荧光报告基团，3’端标记荧光淬灭基团）与模板DNA混合，开始时，探针完整地结合在DNA任意一条单链上，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，检测不到荧光信号；PCR扩增时，遵守聚合酶链反应规律，经过高温变性-低温复性-适温延伸的热循环，Taq酶的5’-3’核酸外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而发出荧光，随着循环次数的增加，切割的荧光分子数与PCR产物的数量成正比，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，可以达到检测PCR产物扩增量的目的。

TaqMan法qPCR

优点

特异性高、定量准确

荧光探针只与目的序列结合，不受非特异性产物的影响

实验耗时短

无需设置熔解曲线检测扩增产物的特异性如何，大大缩短了实验时间

兼容多重反应

不同波长的荧光报告基团可以标记不同的探针，因此可以在同一个反应体系中利用不同荧光标记的探针同时检测多个靶标，达到节省实验成本的目的

TaqMan法qPCR虽好

但实验中扩增曲线也常出现问题

遇上异常不要慌，对症分析解难题

下面让我们认识一下扩增曲线

正常的扩增曲线

图 3 标准扩增曲线示意图

一般呈S型，Ct值最好在20-30之间

标准的基线平直或略微下降，无明显的上扬趋势

曲线拐点清楚，特别是低浓度样本指数期明显，扩增曲线整体平行性好

曲线指数期斜率与扩增效率成正比，斜率越大扩增效率越高

异常的扩增曲线

1. 扩增曲线抖三抖，呈锯齿状不平滑

原因分析

实验操作问题：PCR反应管没有盖紧，反应液泄露；PCR反应液有挂壁

模板问题：RNA纯度低，扩增信号太弱

仪器本身的问题：长时间未校正，荧光不稳定；使用过度，荧光收集不稳定

解决方案

标准化实验操作，检查PCR反应管、PCR反应液等是否规范

增加梯度稀释倍数看优化效果；或重新制备高纯度的RNA模板重复实验

定期进行仪器校准保养

2. 扩增曲线无法达到平台期

原因分析

基因丰度较低

循环数较少

解决方案

增加上样的模板量或选择适合低丰度基因定量的试剂盒

适当增加循环数，一般建议设置循环数为40-45

3.基线不平

原因分析

试剂加完模板后未混匀

可能是buffer内的一些稳定剂导致的

解决方案

试剂离心前充分混匀

优化buffer兼容性

4. NTC有扩增，出现翘尾

原因分析

模板污染或气溶胶污染

引物设计不够优化，有引物二聚体峰

解决方案

更换模板或添加UNG酶

环境通风或换个实验室操作，操作时注意分区加样

更换引物，保证引物特异性

5. 重复性差

原因分析

加样误差

试剂和样品混匀不充分

模板量低

仪器长时间未校准

解决方案

建议移液器定期校准，另外可通过扩大反应体系或提前配制好预混液优化

反应液分装前，可振荡，吹打使反应液充分混匀；上机之前，要离心，避免PCR反应液挂壁

提高模板量，使Ct值落在15-30之间

定期进行仪器校准保养

复孔之间只要ΔCt<0.5就具备良好的重复性

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