细胞表型 | 细胞增殖②MTT实验

MTT实验

（注：每个实验室的具体操作可能会不同，但总原则是不变滴）

1.MTT实验介绍

1)MTT全称为3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，中文化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名 噻唑蓝，是一种黄颜色的染料，其主要作用为检测细胞存活和生长。

2)MTT的检测原理

活细胞线粒体中的 琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为 非水溶性的 蓝紫色结晶甲瓒zā(Formazan)并沉积在细胞中，死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原。 二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm或570nm波长处（常用490nm）测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶溶解所致的吸光度值与细胞数量成正比。根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞数量越多或活性越强(如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小)。

3)应用

①检测药物或其他干预方式对体外培养的细胞的细胞毒性测定；②细胞增殖及活性测定。

4)注意事项

因为MTT最终的量化形式为甲瓒结晶溶解测量吸光度，培养基的本底颜色将会对结果产生极大干扰，故 最终测量前需要抽去培养液上清。因此，本实验主要适用于 贴壁细胞，对于半贴壁或悬浮细胞相关实验，可考虑使用CCK8法。

2.MTT说明书

本实验室MTT来源于VETEC（Sigma-Aldrich集团旗下品牌之一，主要提供实验和生产中经常用到的通用型生化及化学产品）

3.MTT试剂配置方法：

本实验室使用PBS来配置MTT试剂，滤菌后分装于棕色避光小管中，4℃冰箱长期保存（也可以购买配置好的MTT试剂），浓度为5mg/ml

4.MTT/XTT/MTS/CCK8对比

WST-8（CCK8实验试剂）是MTT的一种升级替代产品，和MTT或其它MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点：

首先， MTT被线粒体内的一些脱氢酶还原生成的formazan 不是水溶性的，需要有特定的溶解液来溶解；

而 WST-8和XTT、MTS产生的formazan都是水溶性的，可以省去后续的溶解步骤。其次，WST-8比XTT和MTS更稳定， 使实验结果更加稳定。最后，WST-8和MTT、XTT等相比，线性范围更宽，灵敏度更高。

补充：

XTT比色法由Scudiero等首次采用，用于检测细胞增殖。XTT是一种与MTT类似的四唑氮衍生物，可被活细胞线粒体脱氢酶还原成水溶性的棕色甲肷（qiǎn）产物，当XTT与电子偶合剂共同使用时，甲肷的生成量与细胞的增殖程度呈正相关。

MTS细胞繁殖定量检测试剂是一种新合成的四唑类化合物，它与MTT的应用原理相似，产生水溶性蓝紫色甲簪（zān）产物，作为检测信号来比色定量测定活体细胞繁殖的而经典的技术方法。

PS:虽然cck8更方便，但是它好贵

5.实验设计及注意事项

1） 使用96孔板进行铺板（与CCK8相同）

①确定每孔细胞数

②加样方式

③均匀铺板

④蒸发问题

2） 设计实验组

需要设置 空白组、无药物组和药物组

①空白孔：加入MTT试剂+DMSO

②无药物孔：加入细胞+MTT试剂+DMSO

③药物孔：加入细胞+设置的药物梯度+MTT试剂+DMSO

3） 药物浓度梯度设计

见新推文

6.具体流程

细胞消化到细胞计数部分略（详见细胞传代计数推文）

1）操作前准备+观察

2）超净工作台准备

3） 弃废液+清洗

4） 胰酶消化

5） 其他物品准备

6） 终止消化

7） 高速离心 （1000r，3min，注意对角线配平）

8） 1ml完培重悬细胞沉淀

9） 台盼蓝染色

10） 细胞自动计数（略）

11） 铺96孔板

向无药物孔和药物孔中加入100μL的稀释细胞悬液，可选择两种方法：

①使用 排枪（确保枪头插紧，从移液槽中吸取液体后观察每个枪头中的液体平面是否基本一致）

②使用 20-200μL量程的枪+黄枪头，吸二打一

12） 预培养

将96孔板置于孵培养箱中过夜或孵育24小时，等待细胞贴壁（通常前一天下午铺板，次日上午给药）

13） 加药

于显微镜下观察96孔板内细胞状态，确认细胞密度适宜且已贴壁后准备加药（一般5-7个梯度，每孔100μL，设3-5个复孔，5个复孔最好）

14） 孵育

孵育48小时或更长时间（一般以无药物孔的细胞铺满底部为宜）

15） 加MTT试剂

分装好的MTT试剂浓度是5mg/ml，保存在棕色避光管中，使用时需再稀释十倍（如96个孔按照100孔即10ml计算，需要加入9ml完全/空白培养基+1mlMTT试剂）

向每个孔加入100μL的稀释后的MTT试剂（吸二打一）

16） 再次孵育

将加好MTT的96孔板放入培养箱最底层再次孵育4h（若在细胞间外加MTT试剂，可以将96孔板套上EP手套后消毒再放回敷箱）

17） 终止孵育

将96孔板从细胞间取出，用5ml针筒小心吸去孔内培养液（针尖贴侧壁，注意不要刮掉结晶物）也可以用移液枪/负压吸引器等

可见孔中水不溶性的蓝紫色结晶（不要触碰96孔板底部）

18） 溶解结晶

每孔用排枪加入100μLDMSO（二甲基亚砜），置摇床上低速避光振荡10 min左右，使结晶物充分溶解

加入DMSO后，蓝紫色结晶溶解（注意避光）

19） 测OD值

在酶标仪490nm处测量各孔的吸光值，如下图

20） 分析数据

需要对原始数据进行处理，可用graphpad作图（数据处理和作图见新推送）

参考文献：

Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction

参考链接：

生物小白的入门必修课——MTT实验 - 知乎 (zhihu.com)

细胞毒性实验mtt法（MTT实验最全指南详解剖析）_浙江百越专注科研实验服务 (zjby-biotech.com)

靶细胞杀伤实验：MTT和CCK8比较 - 实验方法 - 丁香通 (biomart.cn)

XTT比色法 - 实验方法 - 丁香通 (biomart.cn)

GENMED-MTS细胞繁殖定量检测试剂盒产品说明书 - 豆丁网 (docin.com)

MTT实验的一些细节问题 - 实验方法 - 丁香通 (biomart.cn)

碎碎念时间

开学大半个月第一次请假出校

竟是因为室友暖壶炸掉烫伤了脚

三个人获得了两个小时的短暂自由

自由的味道真好

旅顺口区人民医院背面-旅顺日本关东法院旧址

感觉这一周也没干什么就过去了

静默瘦的那几斤全吃回来了

感慨一下校内生活的滋润

（之后出个专栏写大医校园美食吧）

实验室一角

校园一角

和小杨同学腾讯会议补完了契约之吻（ 涩涩好康）

你好，这里是DEAR MY WAKER

一个喜欢游戏和galgame以及摸鱼的肿瘤学硕返回搜狐，查看更多