RNA扩增方法与流程

技术特征：

1.一种扩增短RNA分子的方法，所述方法包括，

获得包含短RNA靶分子的RNA样品；

使包含所述短RNA靶分子的样品和至少一种含RNA的模板分子与逆转录酶接触，其中所述短RNA靶分子退火至所述含RNA的模板分子并且所述逆转录酶通过延伸退火的短RNA分子来逆转录所述含RNA的模板分子，以形成包含退火至模板RNA分子的短RNA靶分子/cDNA杂合多核苷酸的双链体；

使所述双链体接触RNA酶H活性，从而在该双链体中的退火至短RNA靶分子/cDNA杂合多核苷酸的脱氧核糖核苷酸的含RNA的模板分子的部分中切下核糖核苷酸；

通过用逆转录酶延伸退火至单链短RNA靶分子/cDNA杂交体的第一寡核苷酸引物，来逆转录短RNA靶分子/cDNA杂合多核苷酸的至少短RNA靶分子部分，以形成包含与所述短RNA靶分子互补的序列的DNA分子；和

用DNA聚合酶扩增包含与所述短RNA靶分子互补的序列的DNA分子，从而扩增所述短RNA序列。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，从外源性来源添加所述第一寡核苷酸引物。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述短RNA是miRNA、snoRNA、piRNA、或lncRNA。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，短RNA长度为30个或更少核苷酸。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含RNA的模板分子是来自样品的天然产生的RNA分子。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一寡核苷酸引物具有12-16个核苷酸并且包含不与单链短RNA靶分子/cDNA杂合多核苷酸互补的5’部分和与单链短RNA靶分子/cDNA杂合多核苷酸互补的3’部分。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一寡核苷酸引物包含与单链短RNA靶分子/cDNA融合多核苷酸互补的至少6个核苷酸的长度。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，第一寡核苷酸引物的3’部分长度为6-10个核苷酸。

9.如权利要求6或8所述的方法，其特征在于，所述第一寡核苷酸引物的5’部分长度为3-6个核苷酸。

10.如权利要求5-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述DNA聚合酶具有6-10个核苷酸的DNA足迹。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述DNA聚合酶连接至具有4-6个核苷酸的DNA足迹的DNA-结合结构域。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含RNA的模板分子对于所述样品是异源的。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述含RNA的模板分子包含(i)与短RNA靶标互补并且包含RNA的3’部分和(ii)当含RNA的模板分子退火至该短RNA靶分子时形成5’突出端的5’部分。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，除了与3’部分连接的5’部分的1-2个核糖核苷酸部分以外，所述5’部分是DNA。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述第一引物是通过RNA酶H活性释放的5’DNA部分。

16.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述3’部分和5’部分是RNA。

17.如权利要求13所述的方法，其特征在于，样品的接触包括使所述样品与短RNA靶标和具有5’部分和3’部分的多个含RNA的模板分子接触，其中所述3’部分包含至少4个核苷酸的简并序列，使得所述多个模板分子包含具有不同3’部分和相同5’部分的多样的含RNA的分子。

18.如权利要求1所述的方法，其特征在于，向所述双链体添加RNA酶H酶，从而使所述双链体与RNA酶H活性接触。

19.如权利要求1所述的方法，其特征在于，RNA酶H酶来自逆转录酶。

20.如权利要求1所述的方法，其特征在于，扩增包括生成扩增子，并且所述方法还包括对所述扩增子进行核苷酸测序。

21.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括对所述样品中的短RNA靶分子的量进行定量。

22.一种扩增长度少于30个核苷酸的非-聚A加尾RNA的方法，所述方法包括

通过延伸具有与RNA互补的至少6个连续核苷酸的第一引物逆转录所述RNA，以产生除引物序列以外包含至少10个核苷酸的长度的序列的第一链cDNA，其与所述RNA互补，

用DNA聚合酶-DNA结合结构域融合物来扩增所述第一链cDNA以延伸第二引物，其中所述DNA聚合酶具有6-10个碱基对的足迹并且所述DNA结合结构域具有3-5个碱基对的足迹，并且其中所述第二引物包含与所述第一链cDNA的3’区互补的连续碱基对，以产生双链cDNA。

23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述第一引物包含不与所述RNA互补的5’部分。

24.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述第二引物包含与所述第一链cDNA的3’区互补的12-16个连续碱基对。

25.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述聚合酶是Taq Stoffel片段或其类似物。

26.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述DNA结合结构域是Sso7d DNA结合结构域。

27.如权利要求22所述的方法，其特征在于，所述RNA是miRNA、snoRNA、piRNA、或lncRNA。

28.如权利要求22-26中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一引物具有与所述RNA互补的6-12个连续核苷酸。

29.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述5’部分的长度是3-6个核苷酸。

30.如权利要求22所述的方法，其特征在于，扩增包括生成扩增子，并且所述方法还包括对所述扩增子进行核苷酸测序。

31.如权利要求22所述的方法，还包括对所述样品中的非-聚A加尾RNA的量进行定量。

32.一种从非-聚A加尾RNA生成cDNA的方法，所述方法包括

用末端转移酶向靶非-聚A加尾RNA的3’末端添加随机聚-W(A/T)或聚-S(G/C)核苷酸序列，以形成在所述分子的3’末端处包含简并核苷酸序列的RNA分子；

使包含随机聚-W或聚-S核苷酸序列的RNA分子经历一定条件使得所述包含随机聚-W或聚-S核苷酸序列的RNA分子退火以形成通过所述随机聚-W或聚-S核苷酸序列退火至彼此的第一和第二RNA分子的双链体；并且

用DNA聚合酶延伸所述双链体中分子的3’末端以形成(i)与所述双链体的第一RNA分子互补的第一cDNA和(ii)与所述双链体的第二RNA分子互补的第二cDNA，其中所述第一和第二cDNA还包含5’序列，其是所述随机聚-W或聚-S核苷酸序列的互补物。

33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述RNA是miRNA、snoRNA、piRNA、或lncRNA。

34.如权利要求32所述的方法，还包括用RNA酶H活性消化RNA分子。

35.如权利要求32所述的方法，还包括用退火至简并序列的互补物的引物扩增所述第一或第二cDNA。

36.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述添加还包括使所述非-聚A加尾RNA与聚A聚合酶接触。

37.如权利要求35所述的方法，其特征在于，扩增包括生成扩增子，并且所述方法还包括对所述扩增子进行核苷酸测序。

38.如权利要求32所述的方法，还包括对所述样品中的非-加尾RNA的量进行定量。