一种同步扩增检测HCMV、HSV1、HSV2和B19的引物、探针、试剂盒及方法与流程

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种同步扩增检测HCMV、HSV1、HSV2和B19的引物、探针、试剂盒及方法。

背景技术：

巨细胞病毒（CMV）、单纯疱疹病毒（HSV）1型和2型、细小病毒B19（B19）是导致先天性宫内感染及围产期感染而引起围产儿畸形的四种常见的人类疱疹病毒。这些病原体感染母体后，引起母体的相关症状并不明显，但可通过胎盘垂直传播给胎儿，从而引起胎儿及新生儿的严重后遗症。新生儿感染的临床症状取决于病毒类型和感染时的胎龄，胎儿感染病毒的风险通常与胎龄呈现负相关，感染后可引起新生儿肺炎、听力异常、高胆红素血症等多器官损伤，也可能累及神经系统造成不同程度的智力障碍及各种瘫痪、失明、失聪等严重后遗症。因此，通过这四种病毒的筛查和监测减少母婴传播是防止胎儿宫内感染的重要手段，可减少先天性感染及降低围产期发病率和死亡率，减少出生缺陷，提高出生人口素质。

目前，国内外对于巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型和2型和细小病毒B19的检测技术主要包括电子显微镜技术、细胞培养技术、免疫学技术等。这些技术各具特点，但因在临床上受灵敏度、特异性、检测周期等问题而未能在临床推广应用。实时荧光定量PCR技术的出现，为病毒检测提供了一种简单快速、特异性强、灵敏度高的方法，因此在临床检测上得到广泛应用。因此，该方法广泛应用于临床分子诊断，大大缩短了检测时间，提高了检测灵敏度和特异性。在核酸单重荧光定量检测领域，国外已经有针对这四种病毒的检测方法。多重检测领域，有利用核酸杂交方法对巨细胞病毒（CMV）、单纯疱疹病毒1型（HSV-1）、单纯疱疹病毒2型（HSV-2）、水痘带状疱疹病毒（VZV）、EB病毒（EBV）和人疱疹病毒6型（HHV-6）进行同步扩增检测的方法。Markoulatos等人采用多重PCR结合电泳分析的方法对MV、HSV-1、HSV-2、VZV和EBV进行检测。Leveque等人利用多重PCR扩增结合DNA芯片对HSV-1、HSV-2、VZV、CMV、EBV、HHV-6、HHV-7、HHV-8和人肠道病毒（HEVs）进行检测。在国内，有针对HSV、HPV的荧光定量PCR多重检测的报道。由此可见，针对多种病毒的多重PCR反应技术已经是相当成熟，但未见这四种病毒的多重荧光定量PCR方法的报道。

技术实现要素：

为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种同步扩增检测HCMV、HSV1、HSV2和B19的引物，该引物能满足多个待检样品在同一个反应体系和反应条件下扩增，引物特异性好。

本发明的另一个目的在于提供一种同步扩增检测HCMV、HSV1、HSV2和B19的探针，该探针特异性好，检测灵敏精确。

本发明的还一个目的在于提供一种同步扩增检测HCMV、HSV1、HSV2和B19的试剂盒，该试剂盒能同步实时检测血液、体液或者分泌物标本中巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1 型和2 型和细小病毒B19核酸是否存在，准确性好，灵敏度高。

本发明的还一个目的在于提供一种含有HCMV、HSV1、HSV2和B19病原体检测序列的阳性质粒的制备方法，该制备方法步骤简单，操作控制方便，质量稳定。

本发明的还一个目的在于提供一种含有HCMV、HSV1、HSV2和B19病原体检测序列的阳性质粒，该阳性质粒的检测准确性好，灵敏度高。

本发明的还一个目的在于提供一种同步扩增检测HCMV、HSV1、HSV2和B19的方法，该方法具有准确、灵敏、窗口期短、效率高等优点，操作相对简便，可降低母婴垂直传播疾病的发病率。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种同步扩增检测HCMV、HSV1、HSV2和B19的引物，包括分别用于扩增HCMV病毒UL75基因、HSV1病毒UL12基因、HSV2病毒UL15基因和B19病毒VP1基因的4对共8条引物，8条引物分别简写为F1、R1、F2、R2、F3、R3、F4和R4；其中，F1和R1的扩增区域位于HCMV病毒全基因序列的110779-110853nt，F2和R2的扩增区域位于HSV1病毒全基因序列的25851-25976nt，F3和R3的扩增区域位于HSV2病毒全基因序列的29401-29487nt，F4和R4的扩增区域位于B19病毒全基因序列的2975-3082nt。

优选的，所述8条引物的序列分别为：

F1：5’-TCGGTCAGATCTACCTGGTTCA-3’

R1：5’-TGTATTCCATATGCCTCGATGTCT-3’

F2：5’-GTCCCGAGGACAGACGAGAATA-3’

R2：5’-CGGCGCTTTATYTTCCACG-3’

F3：5’-CCCAACGCAACGCCTACTAC-3’

R3：5’-GCACGAAGTGAACCAACTGC-3’

F4：5’-CCTGGGCAAGTTAGCRTACAA-3’

R4：5’-ATGAATCCTTGCAGCACTGTCM-3’。

一种同步扩增检测HCMV、HSV1、HSV2和B19的探针，包括分别用于检测HCMV病毒UL75基因、HSV1病毒UL12基因、HSV2病毒UL15基因和B19病毒VP1基因的4条探针。

优选的，所述4条探针分别简写为T1、T2、T3和T4，4条探针的序列分别为：

T1：5’-CTCCGCCAGAGGACCCGCAA-3’

T2：5’-CATGAGGACCCCACACGTATGCACG-3’

T3：5’-TTTCAGGCCCTGCACCGCTCC-3’

T4：5’-ACTAACTATRTTGGGCCTGG-3’。

各引物和探针的设计如下：

1、针对HCMV的UL75基因，设计的扩增序列长度为75bp，位于病毒全基因序列的110779-11085nt之间（参考序列为KR534208.1），Taqman探针荧光基团为5`HEX，淬灭基团为3`BHQ1，扩增序列如下：

TCGGTCAGATCTACCTGGTTCAGAAACTGCTCCGCCAGAGGACCCGCAAAAAGACATCGAGGCATATGGAATACA。

2、针对HSV1的UL12基因，设计的扩增序列长度为 126bp，位于病毒全基因序列的25851-25976nt之间（参考序列为FJ593289.1），Taqman探针荧光基团为5`ROX，淬灭基团为3`BHQ2，扩增序列如下：

GTCCCGAGGACAGACGAGAATATCCAGGGACGCCCCGACCATCCCCGTGTGACCGTCCATGAGGACCCCACACGTATGCACGTTCTCTTCGGCGAGGTCGCTGGGTTCGTGGAAGATAAAGCGCCG。

3、针对HSV2的UL15基因，设计的扩增序列长度为 87bp，位于病毒全基因序列的29401-29487nt之间（参考序列为JN561323.2），Taqman探针荧光基团为5`CY5，淬灭基团为3`BHQ2，扩增序列如下：

CCCAACGCAACGCCTACTACAGCGTCCTGAACACGTTTCAGGCCCTGCACCGCTCCGAAGCCTTTCGGCAGTTGGTTCACTTCGTGC。

4、针对B19的VP1基因，设计的扩增序列长度为 108bp，位于病毒全基因序列的2975-3082nt之间（参考序列为NC_000883.2）， TaqMan-MGB探针荧光基团为5`FAM，扩增序列如下：

CCTGGGCAAGTTAGCGTACAACTACCCGGTACTAACTATGTTGGGCCTGGCAATGAGCTACAAGCTGGGCCCCCGCAAAGTGCTGTTGACAGTGCTGCAAGGATTCAT。

一种同步扩增检测HCMV、HSV1、HSV2和B19的试剂盒，该试剂盒包括上述所述的引物和上述所述的探针。本发明的试剂盒包括四种病原体核酸扩增试剂，其中含有荧光定量反应液、引物、探针、Taq酶、阳性对照等。匹配仪器可使用美国ABI公司的ABI7500荧光定量PCR仪、Bio-Rad公司的Bio-rad chromo4四通道实时定量PCR仪、Roche的Light Cycler 480实时定量PCR仪或安捷伦公司的mx3000p实时定量PCR仪及以上级别定量PCR仪等，但不局限于这些。

本发明的试剂盒的工作原理：

本发明提供的同步扩增检测巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型和2型和细小病毒B19的荧光定量PCR试剂盒中，有标记了荧光基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5’端报告基团产生的荧光因为荧光共振能量转移（FRET）而被3’端非荧光淬灭基团淬灭，故体系中没有荧光信号的变化且本底低。在PCR退火和延伸过程中，探针与模板特异性结合，随着引物的延伸，TaqDNA聚合酶利用其5’端到3’端外切活性对探针进行切割释放出报告基团，这样破坏了两基团之间的荧光共振能量转移(FRET)，报告基团所释放的荧光可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测，荧光量的增加与PCR产物的积累量呈比例关系。对巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型和2型和细小病毒B19的定量可通过与标准品的循环域值（Ct，Threshold Cycle）相比较得出。Ct值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环个数，Ct值与起始模板数呈一定比例关系，Ct值越小，起始模板数越多，相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用阳性梯度标准模板的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可准确测出该样品的起始拷贝数。

在本发明提供的同步扩增检测巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型和2型和细小病毒B19核酸的荧光定量PCR试剂盒中，针对巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型和2型和细小病毒B19检测中的特殊性，对不同的靶片段进行反应体系的优化，并将荧光定量PCR技术和定量检测系统相结合，将其用于巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型和2型和细小病毒B19同步定量检测。通过优化方案，反复试验，研制出同步检测巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型和2型和细小病毒B19荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出10¹个拷贝，可以满足快速同步诊断巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型和2型和细小病毒B19的要求。

一种含有HCMV、HSV1、HSV2和B19病原体检测序列的阳性质粒的制备方法，包括如下步骤：

a、合成HCMV、HSV1、HSV2和B19的扩增片段；

b、将合成后的扩增片段连接到pUC57载体上构建各自的重组质粒；

c、将构建好的重组质粒转化大肠杆菌后大量培养；

d、将培养好的质粒提取后放-80℃冰箱备用。

一种含有HCMV、HSV1、HSV2和B19病原体检测序列的阳性质粒，所述阳性质粒根据上述所述的制备方法制得。

一种采用上述所述的试剂盒同步扩增检测HCMV、HSV1、HSV2和B19的非诊断方法，包括如下步骤：

（1）用紫外分光光度计测定A260对标准品定量，对浓度为10⁷拷贝/μL标准阳性模板进行10倍的系列稀释，制备浓度分别为10⁷拷贝/μL、10⁶拷贝/μL、10⁵拷贝/μL和10⁴拷贝/μL的阳性标准品；

（2）取来自临床样本的四种病原体核酸和同样量的系列稀释的阳性标准品分别加入到含有Taq DNA聚合酶和荧光定量反应液的PCR反应体系中用荧光定量PCR仪进行PCR检测；

（3）通过比较待测样品和相应标准品的Ct值，对待测样品的起始拷贝数进行定量。

优选的，所述步骤（2）中，PCR反应体系（以Mx3000p/LightCycler 480为例）以40μL计为：

10×PCR buffer 4.0μL

5U/μL Taq DNA聚合酶 0.5μL

25mM MgCl₂ 3.0μL

10mM dNTPs 1.0μL

10μM引物F 0.8μL×4

10μM引物R 0.8μL×4

探针 1.6μL×4

模板DNA 2.0μL

灭菌蒸馏水 16.7μL。

优选的，所述步骤（2）中，PCR检测的反应条件为：50℃ 2min，94℃预变性30s，循环过程使用两步法94℃ 5s，60℃ 1min，40个循环。

本发明的有益效果在于：本发明的同步扩增检测HCMV、HSV1、HSV2和B19的引物，该引物能满足多个待检样品在同一个反应体系和反应条件下扩增，引物特异性好。

本发明的同步扩增检测HCMV、HSV1、HSV2和B19的探针，该探针特异性好，检测灵敏精确。

本发明的同步扩增检测HCMV、HSV1、HSV2和B19的试剂盒，该试剂盒能同步实时检测血液、体液或者分泌物标本中巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1 型和2 型和细小病毒B19核酸是否存在，准确性好，灵敏度高。

本发明的含有HCMV、HSV1、HSV2和B19病原体检测序列的阳性质粒的制备方法，该制备方法步骤简单，操作控制方便，质量稳定。

本发明的含有HCMV、HSV1、HSV2和B19病原体检测序列的阳性质粒，该阳性质粒的检测准确性好，灵敏度高。

本发明的同步扩增检测HCMV、HSV1、HSV2和B19的方法，该方法具有准确、灵敏、窗口期短、效率高等优点，操作相对简便，可降低母婴垂直传播疾病的发病率。

本发明创造性地研发了一种一步法单管单酶多项联合检测巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1型/2型和细小病毒B19四种病原体核酸的荧光定量PCR扩增法。本发明的方法实现同管扩增、同时完成四种对优生优育危害较大、较常见病毒的检测。本发明的方法结合荧光探针技术和实时基因扩增检测技术，因此，开展这四种病毒高通量的多重PCR核酸检测方法（MNAT）对有效防止病毒母婴传播、进行优生优育的筛查有着十分重要和实际的意义。

本发明研发了一种实时同步多项检测的基于TaqMan/MGB探针核酸同步扩增法，其特点是使用单管、单酶体系试剂。

本发明的引物、探针、阳性质粒中含四种病原体PCR检测扩增片段的序列以及其互补序列毫无疑问应当受到所申请要求的权利保护之内。

本发明的试剂盒可对巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1 型和2 型和细小病毒B19进行同步定量检测，并可在一定程度上替代传统免疫检测的方法或者作为免疫学方法的补充。

本发明通过进行快速定量多重核酸检测试剂研究，解决产业化相关的生物化学和分子生物学技术问题，组装出4种严重传染病的病原多重定量基因检测试剂盒，以克服传统蛋白检测固有的缺陷和不足，同时弥补现有国内外同类产品的诸多不足，避免这四种重大传染病的血液源传播。本发明的同步多项检测试剂最突出的优点在于该检测试剂的优秀的灵敏度，使其能满足临床同步筛查的极其苛刻的要求。

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

1、特异性好，灵敏度高，定量准确；

2、检测速度快，仅1小时，加上样品核酸的提取制备，不到2.5小时；

3、使用步骤简单，可重复性高；操作简单，产品成本低廉；

4、可同时进行高通量（四种）的样品检测。

附图说明

图1是本发明四重FQ-PCR方法检测HCMV的标准曲线图；

图2是本发明四重FQ-PCR方法检测HSV1的标准曲线图；

图3是本发明四重FQ-PCR方法检测HSV2的标准曲线图；

图4是本发明四重FQ-PCR方法检测B19的标准曲线图；

图5是本发明四重FQ-PCR方法同步检测HCMV、HSV1、HSV2和B19的扩增曲线图；

图6是本发明四重FQ-PCR方法检测临床标本的扩增曲线图。

具体实施方式

为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例及附图1-4对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。

下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南（第二版）：D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南：吕鸿声，科学出版社，1982，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：使用试剂盒制备巨细胞病毒、单纯疱疹病毒1 型和2 型和细小病毒B19标准曲线。

多重检测试剂盒标准曲线的建立（以安捷伦公司的mx3000p为例）

材料：

a、10×PCR缓冲液 4μL，5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL，25mM MgCl₂ 3.0μL，10mM dNTPs 1.0μL，10μmol/L的HCMV、HSV1、HSV2和B19的上下游引物各0.8μL，10μmol/L的HCMV、HSV1、HSV2和B19的探针各1.6μL，模板DNA 2μL,无菌双蒸水16.7μL，反应液总体系为40μL；

b、标准阳性模板贮存液：浓度为10⁷拷贝/μL标准阳性模板，再进行10倍系列稀释；

c、阴性质控标准品：为无菌双蒸水。

方法：

A、将阳性标准模板系列稀释到10⁷拷贝/μL，10⁶拷贝/μL，10⁵拷贝/μL，10⁴拷贝/μL。

B、分别取荧光定量PCR反应液各38μL，取阳性标准模板2μL，并设阴性对照，分别加入不同的PCR反应管，在荧光定量PCR仪上平行做PCR检测。循环条件为: 50℃2min，94℃预变性30s，循环过程使用两步法94℃ 5s，60℃ 1min，40个循环。同步检测FAM、HEX、ROX和CY5。循环结束后，运用仪器自带软件，读取待检样品拷贝数，阴性对照为0；

图1-4为四重FQ-PCR方法检测HCMV，HSV1， HSV2和B19的标准曲线，结果如图所示，标准品质粒浓度在1.0×10⁷-1.0×10⁴copies/ reaction时，标准曲线有良好的线性关系（其斜率均在-3.3±0.3之间、截距均＜45、R2＞0.99。）反复重复试验三次，得到的Ct值进行统计学分析P>0.05，数据差异无显著意义，说明其不同批次之间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性。图5为四重FQ-PCR方法同步检测HCMV、HSV1、HSV12和B19阳性标准品的扩增曲线，浓度分别为1.0×10⁷copies/ reaction、1.0×10⁶copies/ reaction、1.0×10⁵copies/ reaction和1.0×10⁴copies/ reaction，结果显示扩增效率良好，各种病毒无互相干扰。

实施例2：多重检测试剂盒检测临床样本实例（以安捷伦公司的mx3000p为例）

分别取荧光定量PCR反应液各38μL，取阳性标准模板2μL，并设阴性对照，分别加入不同的PCR反应管，在荧光定量PCR仪上平行做PCR检测。循环条件为: 50℃ 2min，94℃预变性30s，循环过程使用两步法94℃ 5s，60℃ 1min，40个循环。同步检测FAM、HEX、ROX和CY5。循环结束后，运用仪器自带软件，读取结果。见图6，阳性标准品和临床样本的扩增曲线，呈现平滑的S型，显示扩增效率较好。根据实施1中的标准曲线可以进行病毒定量结果计算。

上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。