一步法同时检测EBV,CMV,HSV-6疱疹病毒的试剂盒及检测方法与流程

本发明属于分子诊断生物学技术领域，涉及一步法核酸提取及荧光定量PCR检测试剂盒，具体涉及含三个探针的实时荧光定量PCR试剂，检测患者血液、尿液、脑脊液等样本中EBV,CMV,HSV-6三种常见β、γ亚型人疱疹病毒的新型试剂盒。

背景技术：

在性病医院临床上将与人类有关的疱疹病毒称为人类疱疹病毒。疱疹病毒主要侵犯外胚层来源的组织，包括皮肤、粘膜和神经组织。感染部位和引起的疾病多种多样，并有潜伏感染的趋向，威胁人类健康。

疱疹病毒(herpesviruses,HPV)是一群中等大小的双链DNA病毒，有100个以上成员，根据其理化性质分为α、β、γ三个亚科。α疱疹病毒(如单纯疱疹病毒、水痘－带状疱疹病毒)增殖速度快,能引起细胞病变。β疱疹病毒(如巨细胞病毒)，生长周期长，感染细胞形成巨细胞。γ疱疹病毒(如EB病毒)，感染的靶细胞是淋巴样细胞，可引起淋巴增生。疱疹病毒感染的宿主范围广泛，可感染人类和其他脊椎动物。引起人类疾病的疱疹病毒见表1。

表1人类疱疹病毒的种类及其所致的主要疾病

感染后的常见表象为：神经节腺体、肾淋巴组织、淋巴组织热性疱疹；唇、眼、脑感染；生殖器疱疹水痘；带状疱疹单核细胞增多症，眼、肾、脑和先天感染传染性单核细胞增多症、Burkitt淋巴瘤、鼻咽癌、婴儿急疹和其他一些如未知腹痛等病症。

疱疹病毒感染极为普遍,多为隐性感染,少数为显性感染。调查了人群中不同疱疹病毒的血清抗体发现在世界穷困地区的10岁儿童，有约90％感染过单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSV-1)，而成人几乎全部感染过HSV-1。在温带地区，90％的14岁儿童都感染过水痘－带状疱疹病毒。在西欧、英国和美国，约20～80％青少年都感染过巨细胞病毒(CMV)。在第三世界国家中,几乎所有儿童均已感染过CMV。疱疹病毒除EB病毒外均易引起胎儿先天性感染，造成流产、早产、胎儿先天性畸形和出生后持续感染。由于CMV和HSV易引起孕妇的子宫颈感染，胎儿先天性感染的发生率亦较高。婴儿先天性CMV感染发生率为0.5～1.5％。胎儿先天性感染的途径是受染孕妇体内的病毒通过胎盘传播给胎儿或经子宫颈上行感染胎儿。疱疹病毒的致癌性虽未完全肯定，但不少研究证明疱疹病毒感染与某些癌瘤的发生有关。如EB病毒与伯基特氏淋巴瘤和鼻咽癌、HSV-1与唇癌、HSV-2与子宫颈癌密切相关。有人认为此类病毒的基因可以部分或全部整合于寄主细胞的基因中，引起寄主细胞的癌变。疱疹病毒是一类有包膜的DNA病毒,现已发现60种以上。能引起哺乳类、鸟类、两栖类和鱼类的感染。1978年国际病毒命名委员会将疱疹病毒分为α、β和γ三组。能感染人类的单纯疱疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型及水痘－带状疱疹病毒划为α组,巨细胞病毒为β组,EB病毒为γ组。感染人类的疱疹病毒有共同的形态和结构。疱疹病毒呈球形，直径为150～200nm，完整病毒由核心、核壳和包膜组成。病毒的核心为双股DNA,并有少量的酶蛋白。核壳由162个空心管状壳微粒构成20面体。最外一层是包膜，由脂肪和糖蛋白组成，抗原结构存在于糖蛋白中。感染人类的疱疹病毒除EB病毒外，均能在二倍体细胞组织培养中生长，并引起明显的细胞病变。

疱疹病毒感染后，可表现为原发性感染、潜伏性感染或复发性感染。首次感染疱疹病毒无免疫力者为原发性感染。原发性感染疱疹病毒后，病毒在人体细胞中不增殖，亦不破坏细胞，却呈潜伏状态，此时病人无临床症状，这称为潜伏性感染，一旦由于外界刺激，如受凉、外伤、感染、应用免疫抑制剂等人体抵抗力下降，潜伏状态的病毒便重新复制增殖，破坏细胞，引起一系列临床症状，这称为复发性感染。单纯疱疹病毒和水痘－带状疱疹病毒在感觉神经节和三叉神经节、骶神经节中潜伏感染。EB病毒在淋巴细胞中潜伏感染。疱疹病毒感染后产生的免疫力不完全,一些疱疹病毒(如HSV)的减毒活疫苗或常规方法灭活的死疫苗预防接种在研究中，但一些疱疹病毒(如EB病毒)有致癌潜能。上述疫苗有危险性，有人研究从产EB病毒的人淋巴母细胞系细胞中提取EB病毒决定的膜抗原制造疫苗。

由于疱疹病毒感染引起的发热、黄疸、脑炎或脑膜炎等疾病，因症状和体征无特异性，其早期诊断和及时治疗需要依赖于实验室的诊断。目前比较常见的疱疹病毒为1-6型，并且针对1-6型的疱疹病毒案例研究也比较多，症状描述比较明确。

检验病毒的常规检测方法有：1.病毒分离：外周血单个核细胞培养分离病毒是检测疱疹病毒的金标准。以往是抽屉患者外周血单个核细胞。与新鲜的正常外周血淋巴细胞或脐带血淋巴细胞在普昂也中混合培养，但一般需要5-21天。目前，有学者用培养板代替培养小瓶，更便于获取细胞飞片；将其固定在玻片上进行免疫组化监测，可明显减少试剂用量，不但降低成本，而且缩短病毒检出时间(需时仅1天左右)，同时明显减少培养物污染机会，重复性好。2.血清学检测抗体实验室比较常用的诊断方法为血清抗体的测定，具体检测方法有可分为抗原直接检测法和抗体间接检测法。抗原直接检测法由于某些病毒不产生可检测的抗原而导致灵敏度低，抗体间接检测法由于疱疹病毒感染后需1周左右才产生有效浓度的抗体而无法进行早期诊断，且不同疱疹病毒间存在交叉反应，抗体特异性不高。

随着分子生物学技术的迅速发展，聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术，特别是近几年兴起的实时荧光定量PCR技术为病原微生物的检测提供了性方向。它融合了PCR技术和核酸高效扩增、探针技术的高特异性，光谱技术的高敏感性和高精确定量等优点，直接探测PCR过程中荧光信号的变化以获得定量的结果。如中国专利申请CN103866046A公开了一种人疱疹病毒EBV和VZV检测试剂盒，由定量PCR反应液、EBV标准品、VZV标准品、EBV阳性对照品、VZV阳性对照品、阴性对照品、说明书和盒体组成。该发明试剂盒采用实时荧光定量PCR技术和双色荧光探针，能一步法检测人疱疹病毒EBV和VZV，实现了EBV和VZV感染的同步诊断，对阳性病毒能实时准确定量，可满足临床早期、准确诊断EBV和VZV感染的迫切需要，为EBV和VZV感染的及时针对性治疗提供依据。运用PCR技术检测EB病毒DNA主要包括EB病毒核酸的提取和核酸的PCR扩增，但是该试剂盒并未涉及EB病毒核酸提取方面，而在实际运用中，除PCR本身外，核酸提取效率和抗干扰能力对PCR准确检测病毒核酸含量有很大影响。

目前，国内临床上主要采用直接煮沸法、酚-氯仿抽提法或者核酸提取试剂盒对血浆或血清样本中的疱疹病毒核酸进行提取。直接煮沸法提取过程较复杂，且在处理样本时经过煮沸裂解、高速离心富集DNA等多个步骤，样本中的DNA存在损耗，同时直接加热法提取的核酸模板中含有较多的杂质，这些存在的杂质会干扰检测的进行，如蛋白质、肝素等，所以往往需要将核酸提取液进一步纯化，纯化工序冗长且往往达不到预期效果。

技术实现要素：

针对上述问题，除了对α疱疹病毒的三联核酸检测试剂盒之外，对常见的β、γ亚型的人疱疹病毒EBV,CMV,HSV-6发明了一个三联核酸检测试剂盒，该发明提供了一种磁珠法对样本中的进行快速核酸裂解吸附的一步法试剂盒并保持较好的检测灵敏度，以补充疱疹类型的诊断范围。

利用磁珠直接对样本进行提取，而不需要样本的纯化和洗涤，直接用磁珠和扩增的试剂接触进行核酸的扩增，减少了操作步骤，同时，避免了杂质对检测的干扰。

本发明一方面提供一宗检测常见的β、γ亚型人疱疹病毒EBV,CMV,HSV-6三联检测试剂盒，该试剂盒包括裂解液和磁珠悬浮液，其中，裂解液的成分包括1M NaCl、0.01％Triton-X和0.001M KCl，磁珠悬浮液包括羟基修饰的磁珠，多分散系数＜0.2；磁珠为直径小于或等于500nM，其中，磁珠的含量为10mg/mL。

在一些优选的方式中，当裂解液和磁珠溶液混合的时候，两者的体积比为200:1。或者，提供一种混合物，该混合物为溶液混合物，该混合物中包括1M NaCl、0.01％Triton-X和0.001M KCl和0.005微升的10mg/mL的羟基磁珠。或者，按照表1的方式提供磁珠裂解液，该磁珠裂解液由裂解液和磁珠液按照体积200：1的方式混合而成。

在一些优选的方式中，该试剂盒还包括PCR反应扩增的所必须的成分，所述的扩增试剂包括1～10mmol/L的Mg2+，10～50mmol/L的Tris–HCl缓冲液；浓度25mmol/L的K离子，100μg/ml的酶稳定性试剂，例如BSA等。优选的为，扩增试剂中还包括甘油。在一些优选的方式中，还包括特异的探针序列，所述的序列为SEQ.1.1-1.3；SEQ.2.1-2.3和SEQ.3.1-3.3。

另一方面，本发明的目的是提供一种一步法核酸提取及β、γ亚型的人疱疹病毒EBV,CMV,HSV-6三联检测试剂盒，其中给试剂盒包括磁珠裂解液、定量PCR检测液。优选的，该试剂盒还包括：阴性对照、EBV,CMV,HSV-6阳性对照，说明书和盒体组成。具体组份见下表。

表1：磁珠裂解液的组分和体积比例。

表2:扩增试剂的组成和具体成分

优选的，定量PCR检测液含有PCR缓冲液、耐热DNA聚合酶、三种引物和探针。所述的引物为具体为，为表3.

表3：荧光定量PCR扩增引物探针

在一些方式中，还包括阴性对照为TE buffer；阳性对照为EBV,CMV,HSV-6灭活病毒株混合样本。本发明试剂盒应保存于-20℃，反复冻融8次以内。

在一方面，本发明提供一种检测β、γ亚型的人疱疹病毒EBV,CMV,HSV-6三联检测的方法，该方法包括提供表1-3的试剂，核酸的提取步骤和核酸的扩增步骤，其中，核酸的提取包括：

一、核酸DNA提取：

1.将磁珠裂解液取出，振荡摇匀后短暂离心；

2.取合适离心管或者PCR管中每管加入80μL的磁珠裂解液；

3.在步骤2的离心管或PCR管中，每管加入20μL样本；

4.每次测试应至少设置一孔阴性对照(TE buffer)和一孔阳性对照(阳性对照为EBV,CMV,HSV-6灭活病毒株混合样本)，加样方法同样本，阴性和阳性的核酸提取方法和检测样本的方法保持一致。

5.盖好管盖，短暂离心，将离心管或PCR管放在80℃恒温中孵育5min，然后室温放置5min。如果是，八联管可放入PCR仪中，设定80℃×5min，20℃×5min。

6.将步骤5离心管或八联管放在磁力架上静置1-2min；去除液体，保留磁珠，同时不对磁珠做任何进一步的洗过、洗涤或者处理。如不小心吸到磁珠，则将液体打回管内，重新静置1min后再吸。吸弃液体要完全，或者采用自动方法取出掉液体，保留磁珠在PCR管中。

二：荧光定量PCR扩增：

7.用移液枪吸取50μL试剂盒2中的定量PCR检测液，分别加入到步骤6的离心管或八联管中。

8.用移液枪反复吸打至磁珠完全分散(请注意部分枪头可能吸附磁珠，将会影响检测结果，这里的混合也可以不采用移液枪，而是采用震动的方法自动混合)。如为1.5mL离心管，须转移至PCR管或PCR盘中。盖上盖子或封上胶膜。

9.立即放入PCR仪进行扩增检测。如暂时不检测，须将PCR管或PCR盘避光保存在2-8℃冰箱里不超过2小时。

10.在PCR仪里设置以下的循环参数：

95℃×10min；再按95℃×15s 60℃×45s循环40次；

荧光检测在60℃；反应体系为50μL

11.荧光通道检测选用(EBV收集荧光-FAM，CMV收集荧光-NED，HSV-6收集荧光-CY5)；如果用ABI系列的PCR仪器，Quencher Dye选择None。保存文件，运行程序。

12.实验结束，设置合适的阈值线，获得Ct值，判断样本阴性阳性结果。

所有方式中的样本可以是液体类样本：血清、尿液、漱口水、胸水、腹水、脑脊液、房水可以直接用于核酸提取；或者拭子样本，例如鼻咽拭子、痰液类样本，拭子或者痰液样本溶于1-5mL生理盐水中。

有益效果：

1.对核酸进行简便快速提取：用磁珠吸附DNA核酸不经过洗涤洗脱直接用于PCR反应；2.要求的样本量少：一般现有传统技术中的核酸提取样本是1mL，而本发明中对样本的要求是20ul或者更少就可以实现；3.通过荧光定量PCR对β、γ亚型疱疹病毒进行快速检测，有很好的特异性、灵敏度及分型鉴定。

附图说明

图1为本发明一个具体实施方式中的检测阳性或者阴性样本的实验结果图，其中，图1A是检测阴性样本和阳性样本的测试信号图；图1B是EBV阳性，而CMV，HSV-6阴性的检测结果新信号图；图1C是CMV阳性，而EBV，HSV-6阴性的检测结果新信号图；图1D是HSV-6阳性，而EBV,CMV阴性的检测结果新信号图。

图2是特异性检测实验的信号图。

图3是对阳性样本灵敏度检测信号图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明，实施例提供的方案为优选方案，是作为本领域的一般技术人员按照本发明的精髓来裂解如何实践，但不作为对本申请的限定，本申请的范围体现在权利要求中。

说明：在以下实施例子中所用的PCR扩增仪器为Bio-RAD CFX96和ABI 7500。

实施例1：磁珠一步法检测经过确认阳性或者阴性样本的EBV,CMV,HSV-6样本

提供的试剂如下表：

表1：磁珠裂解液的组分和体积比例。

表2:扩增试剂的组成和具体成分

表3：荧光定量PCR扩增引物探针

具体方法如下：

一、核酸DNA提取：

1.将如表1中的磁珠裂解液取出，振荡摇匀后短暂离心。

2.取一八连管五管中各加入80μL的磁珠裂解液，1个用于阴性样本核酸提取，4个用于不同阳性样本核酸提取

3.在步骤2的PCR管中，分别加入20ul以下样本：

4.盖好管盖，短暂离心，将八联管放在80℃恒温中孵育5min，然后室温放置5min。

5.将步骤4离心管或八联管放在磁力架上静置1-2min。用移液器小心地吸去液体。如不小心吸到磁珠，则将液体打回管内，重新静置1min后再吸，吸弃液体要完全。

6.加入50ul上述PCR检测液，振荡混匀后短暂离心。

PCR温控：45℃ 10min；

95℃ 10min；

95℃ 15s，60℃ 45s；40个cycles；

荧光选择FAM、NED、CY5三个通道

结果参见图1，从图一可以看出，图1(图1中是基于发明的方法的EBV、CMV、HSV-6阳性样本及阴性样本实验曲线；其中，图a是一个阴性样本和一个EBV、CMV、HSV-6混合样本；图b是单一EBV阳性样本；图c是单一CMV阳性样本；图d是单一HSV-6阳性样本。)

结果分析

用本发明的磁珠一步法QPCR法能检测准确区分阴性及单一或混合的EBV、CMV、HSV-6三种疱疹病毒阳性，阳性曲线有较好的指数增长信号。

同时，利用现有商业购买的核酸提取试剂盒(康为世纪通用型柱式基因组提取试剂盒CW2298S)并按照商业试剂盒的方法进行，提取产物用本发明的PCR检测液进行扩增，结果发现其Ct值退后1-2个循环cycle，说明小体系样本用传统的提取方式存在较大的损失。

同样的，对于临床确认阳性的样本进行单一和三种混合的唾液样本、拭子样本采用本实施例子1的方法进行核酸的提取，然后进行同样的扩增，同样获得阳性的结果，表明不仅对于质粒样本可以获得阳性，而且对于临床样本仍然可以获得可靠的结果。

实施例子2：特异性试验

按照实施例子1的磁珠核酸提取方法对以下样本进行核酸的提取，PCR扩增体系及扩增条件与实施例子1相同，取7份特异性参考品分别为HSV-1、HSV-2、VZV、轮状病毒、肠道病毒、肺炎链球菌(ATCC 49618)、大肠杆菌(标准菌株ATCC 35150)阳性样本，进行荧光PCR试剂盒的特异性试验。

结果显示(如图2)，表明仅EBV、CMV、HSV-6阳性质粒扩增曲线显示为阳性，而HSV1、HSV2、VZV、轮状病毒、肠道病毒、肺炎链球菌、大肠杆菌阳性样本均没有出现特异性扩增曲线，说明该组合特异性性很高。

同时，利用现有商业诊断产品(达安基因EB病毒核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒、人巨细胞病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光法)、人疱疹病毒6型核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法))进行药物干扰测试发现商业产品对西瓜霜药物干扰的疱疹病毒阳性样本有出现假阴性，而本发明方法测试结果均有正确的扩增曲线，说明同样的样本，本发明检测试剂可以获得更准确跟稳定的检测结果。

实施例子3：敏感性试验

对用EBV、CMV、HSV-6三种质粒混合样本进行稀释(稀释10¹/10²/10³/10⁴/10⁵/10⁶)，然后按照实施例子1的方法和试剂提及的试剂盒操作方式进行PCR扩增各检测三次。

结果如下；

表明：组合中的荧光定量PCR方法最低检测限约为10copies/ul，有较好的灵敏度分辨率。这不仅可以进行很好的检测，而且可以很高的灵敏度，用于检测药物治疗效果也是可以的，这可能与本发明的提取核酸的质量有关系。

同样，对于现有的商业产品(达安基因EB病毒核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒、人巨细胞病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光法)、人疱疹病毒6型核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法))按照现有产品的试剂提取核酸和进行扩增，只能检测到1×10³的阀值，而对于1×10²和1×10¹的样本，不能检测出阳性结果(具体实验数据略)。

本发明说明书中提到的所有专利和出版物都表示这些是本领域的公开技术，本发明可以使用。这里所引用的所有专利和出版物都被同样列在参考文献中，跟每一个出版物具体的单独被参考引用一样。这里所述的本发明可以在缺乏任何一种元素或多种元素，一种限制或多种限制的情况下实现，这里这种限制没有特别说明。例如这里每一个实例中术语“包含”，“实质由……组成”和“由……组成”可以用两者之一的其余2个术语代替。这里采用的术语和表达方式所为描述方式，而不受其限制，这里也没有任何意图来指明此书描述的这些术语和解释排除了任何等同的特征，但是可以知道，可以在本发明和权利要求的范围内做任何合适的改变或修改。可以理解，本发明所描述的实施例子都是一些优选的实施例子和特点，任何本领域的一般技术人员都可以根据本发明描述的精髓下做一些更改和变化，这些更改和变化也被认为属于本发明的范围和独立权利要求以及附属权利要求所限制的范围。