对含有poly(A)的RNA测定的方法及试剂盒与流程

本发明涉及生物信息领域，具体涉及一种对含有poly(a)的rna测定的方法及试剂盒，尤其涉及一种对含有poly(a)的mrna中poly(a)的长度以及mrna全长序列进行测定的方法。
背景技术：
：大多数真核生物的mrna3’末端都有由100-200个腺苷酸a组成的poly(a)尾巴。它是由poly(a)聚合酶催化聚合到转录后的mrna前体3’末端。由一个特异性酶识别切点上游方向13～20碱基的加尾识别信号aauaaa以及切点下游的保守序列gugugug，把切点下游的一段切除，然后再由poly(a)催化，加上poly(a)尾巴。poly-atail保护mrna，免受核酸外切酶攻击，并且对转录终结、将mrna从细胞核输出及进行翻译、microrna的作用都十分重要。2014年以前，测量poly(a)尾巴长度的方法，主要是northernblot和rt-pcr/sanger技术。由于技术的限制，只局限于研究几个基因的poly(a)尾巴长度的作用。2014年随着二代高通量测序技术的发展，几个研究小组开发出基于illumina测序平台的技术，包括tail-seq、pal-seq、pasp-seq，以及在这几个技术的基础上进行技术改进的mtail-seq、pat-seq。这些技术都是在整个基因组水平上，测量转录本的poly(a)的长度。对于含有poly(a)尾的mrna中poly(a)长度的测定还需要进一步改进。技术实现要素：本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种对含有poly(a)的rna测定的方法。本发明的发明人在研究过程中发现：基于二代平台的测序技术，包括tail-seq、pal-seq、pasp-seq等，通过测序所获得信息少，只能获得mrna的3’末端的信息及poly(a)的长度，不能获得mrna的全长信息，不能区分可变剪接体，不能将poly(a)的长度信息与可变剪接体对应起来，也不能获得poly(a)的长度与可变剪接体之间的关系。而且利用这些技术进行测序，准确度偏低，对于连续的同质碱基的测序不准确，所以需要加入了已知poly(a)长度的spike-inrna作为标准，来校正poly(a)的长度。而且各技术的流程操作步骤繁琐，包括两步加接头3’端接头和5’端接头；需要打断rna；需要切胶筛选片段；反转录及pcr等。另外，tail-seq，只局限于有rrna探针的物种；pal-seq，不能测poly(a)序列中g，u，c的修饰，pasp-seq有60％-80％reads是不能使用的。而随着三代测序技术的发展，pacbio公司的三代测序技术，其读长长，由于荧光基团标记在核苷酸3’端磷酸基团上，在dna合成过程中，3’端的磷酸基团随着dna链的延伸被断开，标记物被弃去，减少了dna合成的空间位阻，维持dna链连续合成，延长了测序读长，所以可以准确地读取连续的同类型碱基。三代在测poly(a)的长度上有得天独厚的优势。因此，本申请基于三代测序技术，通过在mrna的3’末端连接接头，并以此接头进行反转录，保留了poly(a)的完整长度，同时利用反转录酶的模板转换的功能获得了mrna的全长片段，然后利用pacbio平台的测序读长长及读取连续碱基的准确性，获得了带有poly(a)准确长度的全长的mrna。具体而言，本发明提供了如下技术方案：本发明提供了一种对含有poly(a)的rna测定的方法，包括：在所述含有poly(a)的rna的3’末端，连接3’接头，以便获得含有3’接头的rna；以所述含有3’接头的rna为模板进行反转录处理，在所述含有3’接头的rna的5’末端连接上5’模板转换接头，以便获得含有3’接头和5’模板转换接头的rna；基于所述含有3’接头和5’模板转换接头的rna，构建测序文库，以便对所述含有poly(a)的rna进行测定。根据本发明的实施例，以上对含有poly(a)的rna测定的方法可以进一步包含如下技术特征：在本发明的一些实施例中，所述含有poly(a)的rna为含有poly(a)的mrna。在本发明的一些实施例中，所述3’接头为3’dna接头。在本发明的一些实施例中，所述3’接头的序列为seqidno:1。在本发明的一些实施例中，所述5’模板转换接头为5’dna接头。在本发明的一些实施例中，所述5’模板转换接头的序列为seqidno:2。在本发明的一些实施例中，利用反转录酶对所述含有3’接头的rna进行反转录处理。在本发明的一些实施例中，所述反转录酶选自下列中的至少一种：superscriptii反转录酶(thermofisher)，smartscribe反转录酶(takara)。在本发明的一些实施例中，在进行所述反转录处理时，所用到的反转录引物为seqidno:3。在本发明的一些实施例中，所述poly(a)位于所述含有poly(a)的rna的3’末端。在本发明的一些实施例中，所述方法进一步包括：基于所述含有3’接头和5’模板转换接头的rna，构建测序文库，以便确定所述含有poly(a)的rna中rna的全长序列和poly(a)的长度。在本发明的一些实施例中，所述方法进一步包括：基于所述含有poly(a)的rna中poly(a)的长度，将所述含有poly(a)的全长的rna序列比对到参考基因组上，以便确定样品的可变剪接体的poly(a)的长度分布。在本发明的一些实施例中，所述参考基因组为hg19。在本发明的一些实施例中，所述方法进一步包括：在所述含有poly(a)的rna的3’末端连接3’接头之前，利用含有poly(t)的磁珠，在待测样品中捕获所述含有poly(a)的rna。在本发明的一些实施例中，所述含有poly(t)的磁珠为含有15～30个poly(t)长度的磁珠。在本发明的一些实施例中，所述含有poly(t)的磁珠为含有oligo(dt)25的磁珠。在本发明的一些实施例中，基于第三代测序技术对所述测序文库进行测序，所述第三代测序技术选自smrt测序技术、纳米孔单分子测序技术。本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括3’dna接头和5’dna接头，所述3’dna接头的序列为seqidno:1，所述5’dna接头的序列为seqidno:2。根据本发明的实施例，以上所述试剂盒还可以进一步包括如下技术特征：在本发明的一些实施例中，所述试剂盒进一步包括含有oligo(dt)25的磁珠，所述oligo(dt)25固定在所述磁珠上。在本发明的一些实施例中，所述试剂盒进一步包括反转录酶，所述反转录酶选自superscriptii酶、smartscribe反转录酶中的至少一种。在本发明的一些实施例中，所述试剂盒基于如下方法对含有poly(a)的rna构建测序文库：在所述含有poly(a)的rna的3’末端，连接3’dna接头，以便获得含有3’dna接头的rna；以所述含有3’dna接头的rna为模板进行反转录处理，在所述含有3’dna接头的rna的5’末端连接5’dna接头，以便获得含有3’dna接头和5’dna接头的rna；基于所述含有3’dna接头和5’dna接头的rna，构建测序文库。本发明所取得的有益效果为：利用本发明的方法对含有poly(a)的rna测定的方法，可以不经过打断，即可获得全长mrna，而不只是3’末端的poly(a)的信息；且能够将poly(a)的长度信息与基因的可变剪接体对应起来，也能获得poly(a)的长度与可变剪接体之间的关系。同时，操作步骤简单方便，建库前仅需3大步，只需一次接头连接，不需要打断，不需要切胶筛选片段，且可以测poly(a)序列中g，u，c的修饰。同时，利用本发明提供的方法，可以借助于三代测序平台测序，一方面，该平台测序长度长，可以获得mrna的全长信息，另一方面，该平台可以对连续的同质碱基进行准确测序。例如在利用荧光单分子测序技术进行测序的过程中，荧光基团标记在核苷酸3’端磷酸上。在dna合成过程中，3’端的磷酸键随着dna链的延伸被断开，标记物被弃去，减少了dna合成的空间位阻，维持dna链连续合成，延长了测序读长，所以可以准确地读取连续的同类型碱基。附图说明图1是根据本发明的实施例提供的对含有poly(a)的rna测定的技术路线图。图2是根据本发明的一个实施例提供的文库的质检图。图3是根据本发明的一个实施例提供的poly(a)长度的密度分布图。图4是根据本发明的实施例提供的smrt测序数据处理示意图。具体实施方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本文中，术语“rna”指的是核糖核酸，是存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。rna的碱基有4种，分别是腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，尿嘧啶。rna包括但不限于mrna、rrna、trna、mirna等等。由术语“dna”指的是脱氧核糖核酸，dna的碱基也有4种，分别是腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶和胸腺嘧啶。本文中，rna和dna不仅仅是指由腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶和尿嘧啶(胸腺嘧啶)形成的核酸序列，还包括任何经过碱基修饰的核酸序列。本文中，“poly(a)”指的是连续n个碱基a的核苷酸序列。在真核生物的mrna的3’末端通常是指100-200个腺苷酸a组成的poly(a)尾巴，是由poly(a)聚合酶催化聚合到转录后的mrna前体3’末端。可以由一个特异性酶识别切点上游方向13～20碱基的加尾识别信号aauaaa以及切点下游的保守序列gugugug，把切点下游的一段切除，然后再由poly(a)催化，加上poly(a)尾巴。poly-atail保护mrna，免受核酸外切酶攻击，并且对转录终结、将mrna从细胞核输出及进行翻译、microrna的作用都十分重要。本文中“含有poly(a)的rna”中poly(a)可以在rna序列的中部，或者是一端，可以存在于3’末端，也可以存在于5’末端。本文中，术语“oligo(dt)25”指的是连续25个碱基t的核苷酸序列，用于同poly(a)进行部分或者全部碱基配对。本文中，术语“5’模板转换接头”指的是在反转录的同时，能够实现5’接头的连接。与传统建库手段，即利用连接酶先连接3’接头，再连接5’接头，然后再进行反转录相区分。本文中术语“可变剪接体”指的是由dna转录得到的mrna，包含若干外显子，经过剪接组合成不同长度的mrna，翻译成不同长度蛋白质。这种由同一基因不同外显子组成的序列称可变剪接体。本发明通过在mrna的3’末端连接接头，并以此接头进行反转录，保留了poly(a)的完整长度，同时利用反转录酶的反转录及模板转换接头的模板转换的功能获得了mrna的全长片段，然后利用pacbio平台的测序读长长及读取连续碱基的准确性，获得了带有poly(a)准确长度的全长的mrna。本发明提供了一种对含有poly(a)的rna测定的方法，所述poly(a)位于所述含有poly(a)的rna的3’末端，该方法包括：在所述含有poly(a)的rna的3’末端，连接3’接头，以便获得含有3’接头的rna；以所述含有3’接头的rna为模板进行反转录，在所述含有3’接头的rna的5’末端连接5’接头，以便获得含有3’接头和5’接头的rna；基于所述含有3’接头和5’接头的rna，构建测序文库，以便对含有poly(a)的rna进行测定。根据本发明的具体实施方式，所述方法进一步包括：基于所述含有3’接头和5’接头的rna，构建测序文库，以便测序确定所述含有poly(a)的rna中rna的全长序列。根据本发明的具体实施方式，所述方法进一步包括：基于所述含有3’接头和5’接头的rna，构建测序文库，利用第三代测序技术确定所述含有poly(a)的rna中poly(a)的长度。根据本发明的具体实施方式，所述方法进一步包括：基于所述含有3’接头和5’接头的rna，构建测序文库，利用第三代测序技术确定所述含有poly(a)的rna中rna的全长序列。根据本发明的具体实施例，所述第三代测序技术包括但不限于：smrt测序技术、纳米孔单分子测序技术中的至少一种。通过这些测序技术实现对于含有poly(a)的rna中poly(a)的长度的测定，还可以获取rna的全长信息。smrt测序技术以smrt芯片为测序载体进行测序反应。smrt芯片是一种带有很多zmw(zero-modewaveguides，零模波导孔)孔的厚度为100nm的金属片。将dna聚合酶、待测序列和不同荧光标记的dntp放入zmw孔的底部，进行合成反应。且荧光标记的位置是磷酸基团而不是碱基。当一个dntp被添加到合成链上的同时，它会进入zmw孔的荧光信号检测区并在激光束的激发下发出荧光，根据荧光的种类就可以判定dntp的种类。此外由于dntp在荧光信号检测区停留的时间(毫秒级)与它进步和离开的时间(微秒级)相比会很长，所以信号强度会很大。其它未参与合成的dntp由于没进入荧光信号检测区而不会发出荧光。在下一个dntp被添加到合成链之前，这个dntp的磷酸基团会被氟聚合物切割并释放，荧光分子离开荧光信号检测区。以oxfordnanoporetechnologies公司的纳米孔单分子测序技术为例，是借助于电信号测序的技术。以α-溶血素为材料制作纳米孔，在孔内共价结合有分子接头环糊精。用核酸外切酶切割ssdna时，被切下来的单个碱基会落入纳米孔，并和纳米孔内的环糊精相互作用，短暂地影响流过纳米孔的电流强度，这种电流强度的变化幅度就成为每种碱基的特征。在本发明的一种具体实施方式中，所述方法进一步包括：在所述含有poly(a)的rna的3’末端连接3’接头之前，利用含有oligo(dt)25的磁珠，在待测样品中捕获所述含有poly(a)的rna。根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，所述试剂盒用于对含有poly(a)的rna构建测序文库。根据本发明的实施例，所述试剂盒采用如下方法构建测序文库：在所述含有poly(a)的rna的3’末端，连接3’接头，以便获得含有3’接头的rna；以所述含有3’接头的rna为模板进行反转录，在所述含有3’接头的rna的5’末端连接5’接头，以便获得含有3’接头和5’接头的rna；基于所述含有3’接头和5’接头的rna，构建测序文库。根据本发明的实施例，所述试剂盒可以包括本领域常规的用于接头连接的缓冲液、3’接头序列或者5’接头序列，以及各种用于连接的连接酶以及反转录酶等。其中3’接头序列可以为seqidno:1，5’接头序列可以为seqidno:2。此外，所述试剂盒还可以包括含有oligo(dt)25的磁珠。所述oligo(dt)25可以规定在磁珠上，用于捕获含有poly(a)的rna。下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。实施例1通用人类参考rna(uhrr，universalhumanreferencerna)标准品全长mrnapoly(a)长度的测量。以通用人类参考rna标准品为例，基于如下方法和原理来构建测序文库，并进行测序获得全长mrna中poly(a)的长度：1)用oligo(dt)25磁珠(货号61006，mrnapurificationkit，lifetechnology)从1μg通用人类参考rna标准品总rna吊取含有poly(a)的rna；2)在rna的3’端，也就是poly(a)3’末端，连接3’dna接头，序列(seqidno:1)为(5’-3’)/rapp/agtcggaggccaagcggtcttaggaagacaa/ddc/；其中，seqidno:1中rapp代表多聚核苷酸的5’端是腺苷酸修饰的，即为非脱氧腺嘌呤，且带有两个磷酸基团；ddc代表多聚核苷酸的3’端是双脱氧胞嘧啶，起到末端封闭的作用。3)利用反转录引物进行反转录，当反转录进行到rna的5’末端时，反转录酶会合成连续的3个胞嘧啶核苷酸c，与5’模板转换接头(seqidno:2)的3个鸟嘌呤核苷酸g配对，其中seqidno:2序列为(5′-aagcagtggtatcaacgcagagtacatrgrgrg-3′；其中rg代表非脱氧的鸟嘌呤核苷酸，即为rna中的鸟嘌呤核苷酸)上，再利用superscriptii反转录酶(货号：18064014，superscripttmiireversetranscriptase，thermofisher)的模板置换功能，以5’模板转换接头为模板完成cdna第一链的延伸，反转录的引物序列(seqidno:3)为(5’-3’)aagcagtggtatcaacgcagagtacnnnnnnnnttgtcttcctaagaccgcttttt，其中n为a，t，c或者g中的任意一种；4)pcr扩增，pcr引物序列(seqidno:4)为aagcagtggtatcaacgcagagtac；5)pacbio文库构建及上机测序。具体实验步骤如下：(1)用oligo(dt)25磁珠(货号61006，mrnapurificationkit，lifetechnology)从1μg通用人类参考rna标准品总rna中，按照标准操作步骤，吊取含有poly(a)的rna，即mrna。(2)以25ngmrna为起始样本按照如下步骤建库，测序。(3)文库2100质检如图2，符合全长转录本的长度分布，从500bp-7000bp，主峰在1kb-2kb之间，符合全长转录本的长度分布。(4)数据下机情况，如表2，下机数据总量为11.58g，是正常下机产量。酶读长为23kb左右，subreads读长1569bp，符合转录组文库的平均长度，p1(每个孔只落入一条序列的比例)为56％，均符合sequel下机数据的范围。表2sequel平台下机数据概况酶读长：建好的文库其序列为环状结构，文库构建过程中双链的cdna用smrt接头连接成环。在测序反应过程中，环状分子会被多次测序，所以测序仪下机的原始数据是以文库序列为单位呈串联重复排列的读取序列结构，数据保留了正义链和反义链的插入片段，3'和5'接头，以及smrt连接接头序列，下机数据即为酶读长，后续经过去接头获得subreads，即为插入片段序列，如果一个环状分子被多次测序，那么一个环状分子将会产生多条subreads(可参考图4)。酶读长越长，代表测序长度越大，得到的subreads的质量也越高。subreads质量值是评价测序准确度的，例如：0.8意思是测序中序列拥有80％(20％的碱基错误率)准确度。p0代表落入零模波导膜孔的文库分子数目为零的比例，即该孔没有发生测序反应。p1代表落入零模波导膜孔的文库分子数目只有一条的比例，为测序正常的孔。p2代表落入零模波导膜孔的文库分子数目有两条的比例，同时发生两个测序反应，信号会相互干扰，产生的测序数据基本不可用。三者之和等于100％。表3ccsreads概况样本文库ccs数平均读取次数平均质量值平均长度(bp)polya文库52712117.000.931313其中，ccs是指多条subreads经过比对组装成的一条最终序列(可参考图4)。平均读取次数是指原始read中能够检测到多少次完整的smrt接头。从上表3可以看到cell产出ccs数为527121，符合每个cell的平均产出为35万-61万的范围，平均读取次数达17次，平均质量值为0.93，说明数据质量很高。将得到的全长转录本(是指ccs中能够检测到3'和5'的接头以及polya尾巴的序列)与人基因组hg19进行比对，其中比对率高达98.59％，唯一比对率为98％，表明我们的数据拥有非常高的比对质量，确定我们得到是全长转录本。(5)我们统计了poly(a)长度，如图3和表4，其中图3中纵坐标代表密度值，密度值越大，代表poly(a)在该范围处的概率越大。从图3和表4可以看出，在9-724bp之间，平均长度为81.96bp，峰值为50bp左右。而常规的pacbio的转录本文库，由于其技术原理的差异，只能得到poly(a)的平均长度为27。表4poly(a)长度统计polya文库常规pacbio转录本文库polya平均长度81.9627.15polya最大长度724492polya最小长度99(6)本发明可以检测到poly(a)序列中间ucg的修饰，以下几条poly(a)序列为例1.aagacaaagaagaagaaaaagaaaagaagagaaaaa(seqidno:5)2.aaaaaaaacaaaaaacaaagaaaaaaaaaaaaaaaaaa(seqidno:6)3.aaaaaaaagaaaaaaaauaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa(seqidno:7)4.auaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa(seqidno:8)(7)本发明可以检测不同可变剪接体的poly(a)长度。如转录本pb1，有3个可变剪接体，其中可变剪接体pb1.1的poly(a)长度为271bp，可变剪接体pb1.2的poly(a)长度为179bp，可变剪接体pb1.3的poly(a)长度为232bp。在本文的描述中，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接或彼此可通讯；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。sequencelisting<110>深圳华大基因科技服务有限公司<120>对含有poly（a）的rna测定的方法及试剂盒<130>pidc3184844<160>8<170>patentinversion3.5<210>1<211>32<212>dna<213>人工序列<220><221><222>(1)<223>为非脱氧腺嘌呤，且带有两个磷酸基团<220><221><222>(33)<223>为双脱氧胞嘧啶<400>1aagtcggaggccaagcggtcttaggaagacaac33<210>2<211>30<212>dna<213>人工序列<220><221><222>(28)..(30)<223>均为非脱氧鸟嘌呤核苷酸<400>2aagcagtggtatcaacgcagagtacatggg30<210>3<211>56<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(26)..(33)<223>nisa,c,g,ort<400>3aagcagtggtatcaacgcagagtacnnnnnnnnttgtcttcctaagaccgcttttt56<210>4<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223><400>4aagcagtggtatcaacgcagagtac25<210>5<211>36<212>dna<213>人工序列<220><223><400>5aagacaaagaagaagaaaaagaaaagaagagaaaaa36<210>6<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223><400>6aaaaaaaacaaaaaacaaagaaaaaaaaaaaaaaaaaa38<210>7<211>53<212>dna<213>人工序列<220><223><400>7aaaaaaaagaaaaaaaauaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa53<210>8<211>37<212>dna<213>人工序列<220><223><400>8auaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa37当前第1页12