一种人鼠嵌合抗HEV全分子IgG及其应用的制作方法

本发明属生物制药领域，涉及一种人鼠嵌合抗hev衣壳的全分子igg抗体及其应用，还涉及上述全分子igg抗体的dna分子、表达载体、宿主细胞。
背景技术：
：单克隆抗体技术已在疾病的诊断和治疗等发挥巨大的作用，极大提高了医疗技术水平，但常规的鼠或其它动物来源抗体因其来源可引起很强的异种免疫反应，在人体应用受到很大限制。尽管国内已成功开发用于hev免疫保护的疫苗，但仍没有可用于免疫被动保护的抗体。hev为典型的人畜共患型病原体，无论在发达国家还是发展中国家均仍有很高感染率，且存在持续性感染。因此，除疫苗的主动免疫保护之外，开发临床可用的被动保护抗体也是十分必要的，且在一部分特殊人群，如肝移植患者，防止感染更是十分必要的。已有证据表明其(修改为hev)可通过输血进行传播，不能被病毒灭活方法阻断。人源化抗体技术也已日渐成熟，已是改变抗体分子本身免疫原性和功能特征的重要方法，同时保持抗体特定的识别特异性。目前已公布的以hev相关抗体多以小鼠为主，可用于临床检测开发，但未能验证其hev的保护效应。本发明所制备的抗体，可有效与hev相结合，阻断病毒的感染，显示了良好的中和特性，且尚无相关功能的人源化抗体的专利报道。技术实现要素：本发明旨在提供一种具有中和作用的人鼠嵌合抗hev抗体igg，以及该抗体cdr区域的核酸及氨基酸序列，抗体可变区核酸及氨基酸序列，抗体全分子氨基酸序列，抗原结合表位氨基酸序列，制备鼠源抗hev抗体的方法，人鼠嵌合抗hev全分子igg的方法，及其对识别并阻断hev感染的能力及用途。本发明提供一种人鼠嵌合抗hev的全分子igg抗体，包括轻链可变区和重链可变区，所述的轻链可变区的核酸序列为seqidno.1所示，所述的重链可变区的核酸序列为seqidno.2所示。进一步的，所述轻链可变区的氨基酸序列为seqidno.3所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；且所述的重链可变区的氨基酸序列如seqidno.4所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。进一步的，所述的轻链可变区的三个抗原互补区cdr的氨基酸序列分别为seqidno.5、seqidno.6、seqidno.7所示；所述的重链可变区的三个抗原互补区cdr的氨基酸序列分别为seqidno.8、seqidno.9、seqidno.10所示。进一步的，所述的全分子igg抗体的亲和力kd为1.339e-8。本发明还提供一种dna分子，其编码上述任一项所述的全分子igg抗体的重链或/和轻链。进一步的，所述轻链氨基酸序列为seqidno.11所示，所述的重链氨基酸序列为seqidno.12所示。本发明还提供一种表达载体，包括所述的dna分子以及与该dna分子操作性相连的表达调控序列。本发明还提供一种宿主细胞，被上述所述的表达载体转化。本发明还提供一种全分子igg抗体在制备与hev相关的病毒的诊断试剂或治疗药物中的应用，所述的全分子igg抗体为上述任一项所述的全分子igg抗体。进一步的，所述的全分子igg在制备阻断hev感染诊断或治疗药物中的应用。更进一步的，所述的全分子igg抗体与hev衣壳蛋白特异性结合，并用于hev的检测。以上所述的全分子igg抗体对hev的orf2蛋白有特异性的结合亲和性。进一步的，所述的全分子igg抗体为人鼠嵌合抗hev全分子igg抗体。本发明另一方面还提供一种表达载体，包括权利要求以上所述的dna分子以及与该dna分子操作性相连的表达调控序列，及提供一种被所述的表达载体转化的宿主细胞。有益效果：本发明使用重组原核表达生产的hev衣壳蛋白免疫小鼠，采用纯化的开放读码框(orf2)表达的衣壳蛋白和病毒阻断筛选方法进行多次筛选，通过杂交瘤技术制备鼠源特异性并具有病毒保护性的单克隆抗体，并采用基因工程技术和抗体工程技术，制备重组人鼠嵌合抗hev保护性全分子igg。该嵌合抗体可有效识别hev，并有效用于hev的检测及免疫被动保护细胞株不被hev感染。附图说明图1为本发明实施例3中的sds-page检测结果图，其中m：proteinmarker；1：纯化浓缩抗体；图2为实施例4中的酶联免疫吸附实验结果图；图3为实施例4中的免疫共沉淀检测结果图，其中m：proteinmarker；control：hepag2细胞；1：kernow病毒株感染细胞；图4为biacoret100抗体亲和力检测结果图；图5为实施例4中的免疫荧光检测结果图，其中5a为orf2检测tritc荧光通道、5b为dapi核染色通道、5c为融合图片；图6为实施例5中的抗hev全分子igg中和保护作用结果图。具体实施方式1.鼠源抗hev杂交瘤细胞的培养和准备。2.鼠源抗hev抗体序列的扩增、测序、分析和鉴定。3.人鼠嵌合抗hev全分子igg的制备、表达及纯化。4.人鼠嵌合抗hev全分子抗体的特性分析。5.抗hev全分子igg阻断感染能力的检测。实施例1.鼠源抗hev衣壳蛋白杂交瘤细胞的培养和准备根据i-iv型hev的基因序列，合成orf2相应序列并克隆入原核表达载体，原核表达纯化相应的抗原。以重组蛋白作为免疫原在纯系balb/c小鼠腹部皮下注射进行免疫接种，每次200μg，共五次，在最后一次免疫接种为细胞融合前七天进行腹腔内加强免疫。融合当天取小鼠脾脏，用dmem培养基(美国gibco公司)制备成单细胞悬液，在50％peg(ph8.0)存在下，将脾细胞和sp2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合，用hat选择性培养基(dmem培养基98ml，ht贮存液1ml，a贮存液1ml)培养7天，换用ht培养基(dmem培养基99ml，ht1ml)培养。实施例2.鼠源抗hev抗体的筛选、制备和鉴定根据杂交瘤细胞生长情况进行酶联免疫法(elisa)检测筛选，具体方法见下述。取检测阳性孔的细胞再次克隆化培养，经过3次亚克隆后，待所有的孔内单克隆细胞上清检测都为抗hev阳性，取数孔扩大培养并部分冻存。采用elisa法筛选抗hev阳性的单克隆抗体的具体步骤如下：(1)纯化原核表达的抗原，包被elisa的96孔板，用包被液(0.1m碳酸盐缓冲液，ph9.6)稀释至2μg/ml，每孔加入100μl，4℃过夜；(2)用pbst洗涤液(pbs含0.05％吐温)洗涤5次后加入3％bsa(200μl/孔)封闭，室温孵育2h，弃去封闭液后4℃保存；(3)每个孔中加入100μl杂交瘤细胞培养上清，以免疫小鼠的血清为阳性对照(1：1000稀释)，以空白组小鼠的血清为阴性对照(1：1000稀释)37℃孵育1h，弃去检测液体，用pbst洗涤液洗涤5次；(4)将以1：5000稀释的羊抗鼠ig-hrp第二抗体(thermo公司)100μl/孔加入到孔内，37℃孵育1h，弃去检测液体，pbst洗涤5次；(5)加入过氧化物酶底物显色液100μl/孔，室温下15分钟后用2m硫酸中止反应，用全波长酶标仪检测(thermolabsystems,usa)，比色采用双波长450nm/630nm，将检测结果大于正常鼠血清od值1.0的定义为阳性克隆。rt-pcr方法筛选能阻断hev感染的抗体，具体方法如下：(1)收集hev感染细胞株(kenow病毒株感染的hepag2细胞株)培养上清，采用超滤法进行病毒浓缩并定量hev的水平，调整病毒滴度为10e6/ml，保存备用；(2)纯化的抗体分别和hev病毒样本37℃孵育2h，方案如下表，设定热灭活组(病毒经65℃处理2小时)和无关抗体组(采用乙肝表面抗原的单克隆抗体)为对照，加上hepag2细胞株共培养8h，弃上清，继续培养10天，期间常规换液和传代细胞；(3)收集上清进行rt-pcr检测hev水平，筛选获得具有中和hev能力的抗hev体一株。纯化的抗体使用美国sigma公司的单克隆抗体亚型鉴定试剂盒(iso-2kt)进行抗体的亚型鉴定，结果显示抗hev抗体的亚型为igg2a。实施例3.人鼠嵌合抗hev全分子igg的制备、表达及纯化复苏杂交瘤细胞，参照trizolreagentkit说明书，提取细胞总rna，rt-pcr方法获得cdna。参照iggblast数据库的统计资料分别设计19条vhforward和17条vκforward引物，4条vhreverse和3条vκreverse引物，引物序列如下：vκforwardprimersvκ-1：5’-gggcccaggcggccgagctcgayatccagctgactcagcc-3’vκ-2：5’-gggcccaggcggccgagctcgayattgttctcwcccagtc-3’vκ-3：5’-gggcccaggcggccgagctcgayattgtgmtmactcagtc-3’vκ-4：5’-gggcccaggcggccgagctcgayattgtgytracacagtc-3’vκ-5：5’-gggcccaggcggccgagctcgayattgtratgacmcagtc-3’vκ-6：5’-gggcccaggcggccgagctcgayattmagatramccagtc-3’vκ-7：5’-gggcccaggcggccgagctcgayattcagatgaydcagtc-3’vκ-8：5’-gggcccaggcggccgagctcgayatycagatgacacagac-3’vκ-9：5’-gggcccaggcggccgagctcgayattgttctcawccagtc-3’vκ-10：5’-gggcccaggcggccgagctcgayattgwgctsacccaatc-3’vκ-11：5’-gggcccaggcggccgagctcgayattstratgacccartc-3’vκ-12：5’-gggcccaggcggccgagctcgayattktgatgacccarac-3’vκ-13：5’-gggcccaggcggccgagctcgayattgtgatgacbcagkc-3’vκ-14：5’-gggcccaggcggccgagctcgayattgtgataacycagga-3’vκ-15：5’-gggcccaggcggccgagctcgayattgtgatgacccagwt-3’vκ-16：5’-gggcccaggcggccgagctcgayattgtgatgacacaacc-3’vκ-17：5’-gggcccaggcggccgagctcgayattttgctgactcagtc-3’vκ3’reverseprimersvκr1：5’-agatggtgcagccacagttcgtttkatttccagyttggtccc-3’vκr2：5’-agatggtgcagccacagttcgttttatttccaactttgtccc-3’vκr3：5’-agatggtgcagccacagttcgtttcagctccagcttggtccc-3’vh5’forwardprimersvh1:5’-gctgcccaaccagccatggccctcgaggtrmagcttcaggagtc-3’vh2:5’-gctgcccaaccagccatggccctcgaggtbcagctcagcagtc-3’vh3:5’-gctgcccaaccagccatggccctcgaggtgcagctgaagsastc-3’vh4:5’-gctgcccaaccagccatggccctcgaggtccarctgcaacartc-3’vh5:5’-gctgcccaaccagccatggccctcgaggtycagctbcagcartc-3’vh6:5’-gctgcccaaccagccatggccctcgaggtycarctgcagcagtc-3’vh7:5’-gctgcccaaccagccatggccctcgaggtccacgtgaagcagtc-3’vh8：5’-gctgcccaaccagccatggccctcgaggtgaasstggtggaatc-3’vh9:5’-gctgcccaaccagccatggccctcgaggtgawgytggtggagtc-3’vh10:5’-gctgcccaaccagccatggccctcgaggtgcagskggtggagtc-3’vh11:5’-gctgcccaaccagccatggccctcgaggtgcamctggtggagtc-3’vh12:5’-gctgcccaaccagccatggccctcgaggtgaagctgatggartc-3’vh13:5’-gctgcccaaccagccatggccctcgaggtgcarcttgttgagtc-3’vh14:5’-gctgcccaaccagccatggccctcgaggtraagcttctcgagtc-3’vh15:5’-gctgcccaaccagccatggccctcgaggtgaarsttgaggagtc-3’vh16:5’-gctgcccaaccagccatggccctcgaggttactctraaagwgtstg-3’vh17:5’-gctgcccaaccagccatggccctcgaggtccaactvcagcarcc-3’vh18:5’-gctgcccaaccagccatggccctcgaggtgaacttggaagtgtc-3’vh19:5’-gctgcccaaccagccatggccctcgaggtgaaggtcatcgagtc-3’vh3’reverseprimersvhr1：5’-cgatgggcccttggtggaggctgaggagacggtgaccgtggt-3’vhr2：5’-cgatgggcccttggtggaggctgaggagactgtgagagtggt-3’vhr3：5’-cgatgggcccttggtggaggctgcagagacagtgaccagagt-3’vhr4：5’-cgatgggcccttggtggaggctgaggagacggtgactgaggt-3’取上述引物，分别扩增vh、vl基因，琼脂糖凝胶电泳回收、纯化扩增的基因片段，并连至pmd18-t质粒，转化至大肠杆菌top10f’后，挑取阳性克隆送公司测序，测序分析后获得轻链、重链可变区基因序列。(1)pcr扩增抗体基因；反应体系如下：反应条件如下：(2)2％琼脂糖凝胶电泳，紫外下观察目的条带，切胶回收；(3)胶回收试剂盒纯化目的dna片段，去离子水洗脱；(4)双酶切igg表达质粒；igg表达质粒pfuse-chig-hg1、pfuse-clig-hk(购自invivogen公司)包含igg1型人源的重链和轻链(kappa)恒定区碱基编码序列。a.pfuse-chig-hg1、pfuse-clig-hk模板载体的双酶切；反应体系如下：反应条件为：37℃酶切过夜。b.1％琼脂糖凝胶电泳，紫外下切胶回收；c.胶回收试剂盒纯化目的dna片段，去离子水洗脱。(5)in-fusion重组表达质粒；名称序列vhf5’-ggtgtccactcgctagaggtccagctgcaa-3’vhr5’-gcccttggtggatgctgaagagacagtgac-3’vkf5’acagacgctcgctgcgacattgtgatgacccag-3’vkr5’-tgcagccaccgtacgttttatttccagctt-3’扩增相应的序列，反应体系、目的条带回收等见实施例2，进行重组克隆目的基因。反应体系如下：反应条件为：50℃孵育15min。取5μl反应液转化感受态细菌，铺于相应抗性的平板上，次日挑克隆送测序。将测序结果正确的克隆保存菌种并扩大培养，提取质粒。(6)抗hev全分子igg的表达a.取50μg重组后的重链质粒于1ml的opti-mem培养基中，取50μg的轻链质粒于1ml的opti-mem培养基中，取200μl的293fectin于2.8ml的opti-mem培养基中，将上述三种混合液室温静置5min；b.将两个质粒混合液混合均匀后，补加500μl的opti-mem培养基混合均匀后直接加入转染试剂293fectin的混合液，混合均匀后静置20min。期间处理293f细胞，将293f细胞离心后用293fexpressionmedium重悬，然后计数以及用台盼蓝计算细胞活力比，吸取1.00×108个细胞于培养瓶中，用293fexpressionmedium定容至94ml；c.20min结束后将6ml的dna、293fectin的复合物加入准备好的293f细胞中；d.将细胞放在摇床培养箱中培养，培养条件8％co2，120rmp，37℃，6天后收集细胞上清。(7)抗hev全分子igg的纯化；将收集的细胞培养上清用0.45μm的滤膜过滤，同时过滤平衡液和洗脱液。使用akatap100蛋白纯化系统按照proteina纯化的标准步骤纯化，以1ml/min的流速上样，以1.5ml/min的流速洗脱。纯化蛋白后进行sds-page鉴定，结果见图1。实施例4.人鼠嵌合抗hev全分子抗体的特性分析1)酶联免疫吸附实验用包被液(0.1m碳酸盐缓冲液，ph9.6)稀释hev重组蛋白至2μg/ml包被eia高亲和力96孔板，每孔加入100μl，4℃过夜；弃去液体，pbst洗涤5次后，用pbst(pbs含0.5％tween20)5％bsa-洗涤缓冲液封闭，室温孵育2h；弃去液体，4℃保存；检测时室温平衡半小时后每孔加入100μl倍比稀释的抗hev全分子igg(浓度分别为：1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml，共7个稀释度)，37℃孵育1h；弃去液体，pbst洗涤5次后，每孔加入100μl羊抗人二抗(1：2000稀释)，37℃孵育1h；弃去液体，pbst洗涤5次后，加过氧化物酶底物显色液，37℃显色15min后用2m硫酸中止反应，上机检测吸光度值。结果如图2示，人源化抗体能与重组hev衣壳蛋白起明显的抗原抗体反应。2)免疫共沉淀分别将感染kewnow病毒株(hev)的人肝癌细胞株裂解蛋白与5μg人源化抗体混合，用pbs定容到300μl,放置于4℃环境共孵育；2h后加入proteina免疫磁珠，继续孵育1h。离心10min去除上清，用pbst漂洗5遍后，加入50μl柠檬酸洗脱液，离心并收集上清，加入10μltris-base中和上清液。使用western-blot鉴定一抗为猴抗hev多克隆抗体(1：1000稀释)，二抗为hrp标记羊人igg多克隆抗体(1：5000稀释)，结果显示人源化抗体能与hev衣壳蛋白结合并共共沉淀，如图3所示。3)亲和力检测根据等电点以及按照biacorex100controlsoft的protocol优化偶联条件，斜率优化选择醋酸钠作为偶联稀释缓冲液。用此缓冲液稀释人源化抗体样品至25ug/ml后偶联到cm5芯片(ge#br100012)上。预设偶联水平1500ru。用ph7.4的runningbuffer稀释mab系列样品,稀释一系列浓度125nm、250nm、625nm、1250nm、2500nm。设置进样时间为180s，解离时间10min，再生缓冲液用50mmph2.2gly-hcl。按照biacorex100controlsoft的protocol进行上机测试。经检测抗体的亲和力kd为1.339e-8(见图4)。4)免疫荧光检测将感染kewnow病毒的细胞株进行玻璃爬片培养，待细胞汇合度达90％以上时，取出细胞片进行冰丙酮溶液固定；pbst洗去丙酮溶液，加入100μl人源化抗体(1μg/ml)，37℃孵育1h，用pbst漂洗5遍后，加入100μl的tritc标记羊人抗体(1：5000稀释)，37℃孵育1h，用pbst漂洗5遍后，加入dapi进行封片，在特定波长的共聚焦显微镜下进行观察。纯化的人源化抗体进行kernow病毒株感染hepag2免疫荧光检测，工作浓度为1μg/ml，采用共聚集显微镜进行拍照成像，如图5所示，图像分别为orf2检测tritc荧光通道(图5a)，dapi核染色通道(图5b)及融合图片(图5c)。实施例5.抗hev全分子igg中和阻断作用检测1)收集感染kewnow病毒的细胞株，超滤浓缩进行病毒定量，调整为1*10e6/ml后备用；2)取200μl浓缩病毒液，加入纯化抗体20μl(1μg/μl，用完全培养基稀释并过滤除菌)，37℃共孵育2℃小时，设立相应对照；3)常规培养hepg2亚克隆细胞株c3a，接种细胞至24孔板中，整日加入准备好的病毒样品，每孔加220μl及1.78ml的完全培养基，37℃培养8小时后，更换培养基；4)常规换液及传代，第8天后进行hev定量pcr检测，判断是否抗体阻断的感染。结果见图6，其中，组1为抗体对照组，组2为抗体保护组，保护组ct均大于35(阴性均以ct＝35计)，表明未能检测到hevrna。sequencelisting<110>南京医科大学<120>一种人鼠嵌合抗hev全分子igg及其应用<130>111<160>12<170>patentinversion3.3<210>1<211>321<212>dna<213>人工序列<400>1gacattgtgatgacccagtctcaaaaattcatgtccacatcagtaggagacagggtcagc60gtcacctgcaaggccagtactaatcagaatgtgggtgtagcctggtatcaacagaaacca120gggcaatctcctaaaacactgatttactcggcatcctaccggtacagtggagtccctgat180cgcttcacaggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcaatgtgcagtct240gaagacttgacagagtatttctgtcagcctaacaccctccaatattatacgttcggaggg300gggaccaagctggaaataaaa321<210>2<211>355<212>dna<213>人工序列<400>2gaggtccagctgcaacaatctggacctgaactagtgaagactggggcttcagtgaagata60tcctgcaaggcttctggtactggttactcattctactacatgcactgggtcaagcagagc120catggaaagagccttgagtggattggatatattagtggtgattgttacaatactaggtac180aaccagaagttcaagggcaaggccacatttactgtagacacatcctccagcacagcctac240atgcagttcaacagcctgacatctgaagactctgcggtcttttactggaaactgggtgca300agagaggggggttttgattattggagccaagggactctggtcactgtctcttcag355<210>3<211>107<212>prt<213>人工序列<400>3aspilevalmetthrglnserglnlysphemetserthrservalgly151015aspargvalservalthrcyslysalaserthrasnglnasnvalgly202530valalatrptyrglnglnlysproglyglnserprolysthrleuile354045tyrseralasertyrargtyrserglyvalproaspargphethrgly505560serglyserglythraspphethrleuthrileserasnvalglnser65707580gluaspleuthrglutyrphecysglnglntyrprotyrasnthrleu859095thrpheglyglyglythrlysleugluilelys100105<210>4<211>118<212>prt<213>人工序列<400>4gluvalglnleuglnglnserglyprogluleuvallysthrglyala151015servallysilesercyslysalaserglythr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