基于恒温扩增与基因编辑的核酸一步检测方法与流程

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及基于恒温扩增与基因编辑的核酸一步检测方法。

背景技术：

从检验试剂产品发展的历程中，可区分出四种重要的主流技术阶段演变，包括化学分析技术、酶分析技术、免疫分析技术、以及分子生物分析技术。而其中分子诊断试剂产品，由于其具有高专一性与灵敏度、实时快速等特性，将在未来检验试剂的发展历程中，占有主导地位。新一代检验试剂的发展趋势主要是朝向更快速、操作更方便、价格更便宜与能执行定点检验(point-of-caretest；poct)的方向迈进。目前，我国正朝向分级分诊医疗制度改革的进行之中，便捷快速且无需昂贵仪器的诊断试剂将适合基层医疗单位以及现场(onsite)检测应用，无疑具有重要的学术意义和市场价值。随者健康医疗保健市场的持续扩大，相关检验市场的需求也逐年扩大。未来的分子诊断产品市场发展，也必将朝向既能于实验室(lab)内又能于现场执行核酸检验的poct产品发展，而能整合核酸萃取、核酸扩增反应及结果侦测系统的技术平台，也是检验市场未来的趋势与方向。

快速，灵敏的核酸检测可以应用于诸多方面，例如对流行性的病原体检测，体检中对特定基因的检测，分辨基因分型，以及各种实验室的研究任务。对预防传染病的传播，疾病的早期筛查，以及加快实验室的实验进度有着重大意义。目前核酸检测的方法还停留在pcr方法，由于反复变温造成耗费时间长，步骤十分复杂，且成本较高。pcr方法需要对温度进行设置，需要特殊的仪器才能进行，从而限制了其使用范围。同时，pcr的灵敏度达不到单拷贝检出，很可能漏检极微量的核酸，同时操作中开盖会造成十分严重的气溶胶污染，对接下来的检测造成假阳性的干扰。

本发明中我们描述了一种基于恒温扩增与基因编辑技术一步法快速检测样品中是否存在目的核酸的方法。该方法在室温中进行，适用于dna与rna，方法简单快速，检测灵敏度高，检测荧光的仪器简便，反应开始后不开盖，杜绝核酸气溶胶污染。整个检测过程仅需20-40分钟。

技术实现要素：

本发明描述了一种基于恒温扩增与基因编辑技术快速一步法检测样品中是否存在目的核酸的方法，所述方法包含下述试剂与步骤，包括：将待检测的样品的核酸提取液，引物以及检测所需的引导rna(crrna)，荧光探针，与恒温扩增酶加入反应缓冲液中形成核酸扩增混合液；37℃-42℃反应10-20分钟后经过离心将置于pcr管盖上的基因编辑酶加入到反应体系中检测目的核酸是否存在，整个过程大约需要30分钟。当目的核酸存在时，基因编辑酶切割探针产生的荧光可以在蓝光、紫外灯或荧光显微镜下用肉眼直接观察到，或其他荧光检测仪器如实时荧光pc仪、酶标仪亦可通过实时荧光曲线探到。

发明的目的在于提供基于恒温扩增与基因编辑的核酸一步检测方法，解决了目前核酸检测的方法还停留在pcr方法，由于反复变温造成耗费时间长，步骤十分复杂，且成本较高，pcr方法需要对温度进行设置，需要特殊的仪器才能进行，从而限制了其使用范围，同时，pcr的灵敏度达不到单拷贝检出，很可能漏检极微量的核酸，同时操作中开盖会造成十分严重的气溶胶污染，对接下来的检测造成假阳性的干扰的问题。

本发明是这样实现的，基于恒温扩增与基因编辑的核酸一步检测方法，该检测方法包括以下步骤：

步骤一、将待检测的样品的核酸提取液、检测目标的特定引物、检测所需的引导rna(crrna)、荧光探针、恒温扩增酶与反应缓冲液置于pcr管中混合，形成核酸扩增混合液，将所述核酸扩增混合液置于37-42℃的金属浴、水浴或者pcr仪器中反应10-20min；

步骤二、通过离心，将置于pcr管盖上的基因编辑酶加入反应体系中，在37℃条件下金属浴、水浴或者pcr仪器中反应10-20min；

步骤三、步骤二完成后，将pcr管置于蓝光或紫外灯下用肉眼直接观察，或通过荧光检测仪器探测。

本发明的进一步技术方案是：待测核酸为dna或rna。

本发明的进一步技术方案是：荧光探针，序列长度为5，其序列为ttatt或tccct或ttctt，一端含有荧光基团修饰：5-fam或fitc，另一端含有淬灭基团修饰：bhq1或tamra，基因编辑酶只有在识别并切割到目的核酸后才会对荧光探针进行旁侧附属切割，进而发出荧光。

本发明的进一步技术方案是：所述方法中核酸扩增混合液包括：重组酶，辅助蛋白，单链dna结合蛋白，dna聚合酶，正向引物，反向引物，引导rna(crrna)，荧光探针以及反应缓冲液；如果模板是rna核酸扩增反应溶液还需要逆转录酶。其中重组酶，辅助蛋白，单链dna结合蛋白，dna聚合酶，正向引物，反向引物提供了核酸的恒温扩增，从而增加模板核酸被基因编辑酶识别的概率；引导rna(crrna)帮助并引导基因编辑酶识别并结合模板核酸，从而对探针进行旁侧附属切割，进而发出荧光。

所述方法的进一步技术方案是：所述核酸扩增混合液包括：80-600ng/ul重组酶t4噬菌体uvsx蛋白或大肠杆菌reca，20-380ng/ul辅助蛋白t4噬菌体uvsy蛋白，200-800ng/ul单链结合蛋白gp32，10-300ng/uldna聚合酶，0.2-0.6um正向引物，0.2-0.6um反向引物，100-800nm引导rna(crrna)，10-400nm荧光探针以及反应缓冲液，如果模板是rna核酸扩增混合液还需要10-600ng/ul逆转录酶。

本发明的进一步技术方案是：所述方法中的反应缓冲液包括：10-200mmnacl，20-200mmtris-hcl，2-20mmmgcl2,5-20mmmgac，1-10mmdtt，4-12％(w/v)聚乙二醇，20-100mm乙酸钾，1-20mmatp，0.1-4mmdntps，10-100mm磷酸肌酸，10-80ug/u肌酸激酶,缓冲液的ph值为7.5-8.5。缓冲液保证了体系中各个组分在适当的盐离子环境下正常工作，保证检测的效率。

本发明的进一步技术方案是：所述方法中的基因编辑酶为cas12a蛋白来自于毛螺菌科细菌：lachnospiraceaebacteriumnd2006，经基因工程将cas12a蛋白基因克隆到大肠杆菌中进行大量提纯。

本发明的进一步技术方案是：所述方法中的蓝光波长为440-485nm，其他荧光探测器亦可，例如：紫外等，荧光显微镜，酶标仪，实时荧光pcr仪等。

本发明的有益效果：本发明采用的方法将基因编辑酶cas12a蛋白放入管盖，基因编辑酶cas12a蛋白的质量浓度为50-500ng/ul，在前期核酸扩增中与其他组分分离，保证核酸扩增的充分进行，反应结束后经离心将cas12a蛋白加入反应中，使其探测目的核酸的存在，整个检测过程不需要开盖，杜绝了污染，真正实现了一室化、无污染、简单快速的核酸检测，并且检测灵敏度超高，重复性及稳定性很好，是核酸检测优选的方法；

该方法在室温中进行，适用于dna与rna，方法简单快速，检测灵敏度高，检测荧光的仪器简便，反应开始后不开盖，杜绝核酸气溶胶污染，整个检测过程仅需20-40分钟。

附图说明

图1是本发明提供的恒温扩增与基因编辑的核酸一步检测方法流程图；

图2是本发明提供的核酸一步检测鼻咽拭子中肺炎支原体的荧光曲线与荧光结果图；图中1为阳性对照、2-4为荧光定量pcr确诊的肺炎支原体感染的鼻咽拭子样本、5为阴性对照；

图3是本发明提供的核酸一步检测呼吸道分泌物中甲型流感的荧光曲线与荧光结果图；图中1为阳性对照、2为荧光定量pcr确诊的甲型流感感染的分泌物样本、3为阴性对照；

图4是本发明提供的核酸一步检测血清中乙型肝炎hbv病毒的的荧光曲线与荧光结果图；图中1为阳性对照、2为荧光定量pcr确诊的乙型肝炎hbv病毒感染的血清样本、3为阴性对照；

图5是本发明提供的核酸一步检测阴道中人乳头瘤病毒hpv16型的荧光曲线与荧光结果图；图中1为阳性对照、2为荧光定量pcr确诊的人乳头瘤病毒hpv16型感染的阴道样本、3为阴性对照；

图6是本发明提供的核酸一步检测本发明检测百日咳杆菌核酸灵敏度的结果图；图中1-7分别为稀释浓度10⁷copies、10⁶copies、10⁵copies、10⁴copies、10³copies、10²copies、10¹copies的百日咳杆菌核酸质粒，8为阴性对照；

图7是对照运用实时荧光定量pcr检测百日咳杆菌核酸灵敏度的结果图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，及本发明较为优选的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，本发明的保护范围并不局限于本文所描述的实施例。相反地，提供以下具体实施例的目的是对本发明的内容理解更加全面透彻。

除非另有定义，本文所使用的所有的科学技术术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意和所有的组合。

实施例一：鼻咽拭子中肺炎支原体的检测

准备1份肺炎支原体病毒培养液(已灭活)作为阳性对照，3份已用荧光定量pcr确诊的肺炎支原体感染的鼻咽拭子样本与1份健康人的鼻咽拭子样本作为阴性对照(拭子保存于hanks液或生理盐水中)，充分震荡后将拭子沿离心管壁按压使得拭子上的液体完全压出。接着运用天根试剂盒hi-swabdnakit高效口腔拭子基因组dna提取试剂盒(dp362)提取上述3组样本中的核酸，操作严格按照说明书描述的步骤。

将上述提取好的核酸2ul加入0.2mlpcr管中，同时在pcr管中加入44ul的核酸恒温扩增液，在pcr管盖上加入4ulcas12a基因编辑酶。所用的核酸恒温扩增液包含重组酶t4噬菌体uvsx蛋白，辅助蛋白t4噬菌体uvsy蛋白，单链结合蛋白gp32，dna聚合酶bsu，正向引物，反向引物，引导rna(crrna)，荧光探针以及反应缓冲液；反应缓冲液包括nacl，tris-hcl，mgcl2,mgac，dtt，聚乙二醇，乙酸钾，atp，dntps，磷酸肌酸，肌酸激酶。其中重组酶t4噬菌体uvsx蛋白的质量浓度为80ng/ul，辅助蛋白t4噬菌体uvsy蛋白的质量浓度为40ng/ul，单链结合蛋白gp32的质量浓度为500ng/ul，dna聚合酶bsu的质量浓度为100ng/ul，正向引物的摩尔浓度为0.4um，反向引物的摩尔浓度为0.4um，引导rna(crrna)的摩尔浓度为0.6um，荧光探针的摩尔浓度为0.2um；其中反应缓冲液的nacl的摩尔浓度为50mm，tris-hcl的摩尔浓度50mm，mgcl2的摩尔浓度为20mm,mgac的摩尔浓度为14mm，dtt的摩尔浓度为5mm，聚乙二醇的质量体积比为7％，乙酸钾的摩尔浓度为50mm，atp的摩尔浓度为6mm，dntps的摩尔浓度为1.2mm，磷酸肌酸的摩尔浓度为50mm，肌酸激酶的酶活为20ug/u，反应缓冲液的ph值为8.0；其中pcr管盖上cas12a基因编辑酶的质量浓度为120ng/ul。

将上述混合好的含有核酸恒温扩增液的pcr离心管置于宏石荧光定量pcr仪slan96p，设置为37℃反应15分钟(不检测荧光)。

反应15分钟后经过小型掌上离心将pcr管盖上的cas12a基因编辑酶加入混合液中，置回荧光定量pcr仪并设置为37℃反应20分钟，fam通道每20s收集一次实时荧光。

反应结束后将上述含有反应液的pcr管拿到紫外灯下照射，并拍摄紫外透射的图像。

通过将荧光定量pcr仪收集到的荧光曲线与紫外透射的拍摄图像结果分析，发现两种模式得到的结果相一致，即3份待测样本与阳性对照均出现明显的荧光扩增曲线，同时紫外透射下呈现强烈的荧光，检测结果为阳性；而1份健康人的鼻咽拭子样本并未出现荧光扩增曲线，同时紫外透射下不发出任何荧光信号，检测结果为阴性。与实际用荧光定量pcr确诊的结果相一致，准确性好，检测快速，整个检测过程不需要开盖，杜绝了污染，真正实现了一室化、无污染、简单快速的核酸检测，是核酸检测优选的方法。

实施例二：呼吸道分泌物中甲型流感病毒的检测

准备1份甲型流感病毒培养液(已灭活)作为阳性对照，1份已用荧光定量pcr确诊的甲型流感感染的分泌物样本，与1份健康人的呼吸道分泌物样本作为阴性对照。接着运用天根试剂盒病毒基因组dna/rna提取试剂盒(dp315)提取上述3组样本中的核酸，操作严格按照说明书描述的步骤。

将上述提取好的核酸2ul加入0.2mlpcr管中，同时在pcr管中加入44ul的核酸恒温扩增液，在pcr管盖上加入4ulcas12a基因编辑酶。所用的核酸恒温扩增液包含重组酶t4噬菌体uvsx蛋白，辅助蛋白t4噬菌体uvsy蛋白，单链结合蛋白gp32，dna聚合酶bsu，逆转录酶mmlv，正向引物，反向引物，引导rna(crrna)，荧光探针以及反应缓冲液；反应缓冲液包括nacl，tris-hcl，mgcl2,mgac，dtt，聚乙二醇，乙酸钾，atp，dntps，磷酸肌酸，肌酸激酶。其中重组酶t4噬菌体uvsx蛋白的质量浓度为100ng/ul，辅助蛋白t4噬菌体uvsy蛋白的质量浓度为50ng/ul，单链结合蛋白gp32的质量浓度为400ng/ul，dna聚合酶bsu的质量浓度为160ng/ul，逆转录酶mmlv的质量浓度为350ng/ul，正向引物的摩尔浓度为0.46um，反向引物的摩尔浓度为0.46um，引导rna(crrna)的摩尔浓度为0.5um，荧光探针的摩尔浓度为0.2um；其中反应缓冲液的nacl的摩尔浓度为50mm，tris-hcl的摩尔浓度10mm，mgcl2的摩尔浓度为20mm,mgac的摩尔浓度为14mm，dtt的摩尔浓度为10mm，聚乙二醇的质量体积比为5％，乙酸钾的摩尔浓度为20mm，atp的摩尔浓度为10mm，dntps的摩尔浓度为2mm，磷酸肌酸的摩尔浓度为80mm，肌酸激酶的酶活为40ug/u，反应缓冲液的ph值为7.9；其中pcr管盖上cas12a基因编辑酶的质量浓度为100ng/ul。

将上述混合好的含有核酸恒温扩增液的pcr离心管置于宏石荧光定量pcr仪slan96p，设置为42℃反应15分钟(不检测荧光)。

反应15分钟后经过小型掌上离心将pcr管盖上的cas12a基因编辑酶加入混合液中，置回荧光定量pcr仪并设置为37℃反应20分钟，fam通道每20s收集一次实时荧光。

反应结束后将上述含有反应液的pcr管拿到紫外灯下照射，并拍摄紫外透射的图像。

通过将荧光定量pcr仪收集到的荧光曲线与紫外透射的拍摄图像结果分析，发现两种模式得到的结果相一致，即待测样本与阳性对照均出现明显的荧光扩增曲线，同时紫外透射下呈现强烈的荧光，检测结果为阳性；而健康人的呼吸道分泌物样本并未出现荧光扩增曲线，同时紫外透射下不发出任何荧光信号，检测结果为阴性。与实际用荧光定量pcr确诊的结果相一致，准确性好，检测快速，整个检测过程不需要开盖，杜绝了污染，真正实现了一室化、无污染、简单快速的核酸检测，是核酸检测优选的方法。

实施例三：血清中乙型肝炎hbv病毒的检测

准备1份乙型肝炎hbv病毒培养液(已灭活)作为阳性对照，1份已用荧光定量pcr确诊的乙型肝炎hbv病毒感染的血清样本与1份健康人的血清样本作为阴性对照。接着运用天根试剂盒tianampblooddnakit血液基因组dna提取试剂盒(dp316)提取上述3组样本中的核酸，操作严格按照说明书描述的步骤。

将上述提取好的核酸2ul加入0.2mlpcr管中，同时在pcr管中加入44ul的核酸恒温扩增液，在pcr管盖上加入4ulcas12a基因编辑酶。所用的核酸恒温扩增液包含重组酶t4噬菌体uvsx蛋白，辅助蛋白t4噬菌体uvsy蛋白，单链结合蛋白gp32，dna聚合酶bsu，正向引物，反向引物，引导rna(crrna)，荧光探针以及反应缓冲液；反应缓冲液包括nacl，tris-hcl，mgcl2,mgac，dtt，聚乙二醇，乙酸钾，atp，dntps，磷酸肌酸，肌酸激酶。其中重组酶t4噬菌体uvsx蛋白的质量浓度为60ng/ul，辅助蛋白t4噬菌体uvsy蛋白的质量浓度为30ng/ul，单链结合蛋白gp32的质量浓度为200ng/ul，dna聚合酶bsu的质量浓度为180ng/ul，正向引物的摩尔浓度为0.36um，反向引物的摩尔浓度为0.36um，引导rna(crrna)的摩尔浓度为0.5um，荧光探针的摩尔浓度为0.18um；其中反应缓冲液的nacl的摩尔浓度为50mm，tris-hcl的摩尔浓度10mm，mgcl2的摩尔浓度为15mm,mgac的摩尔浓度为14mm，dtt的摩尔浓度为8mm，聚乙二醇的质量体积比为6％，乙酸钾的摩尔浓度为25mm，atp的摩尔浓度为8mm，dntps的摩尔浓度为2mm，磷酸肌酸的摩尔浓度为80mm，肌酸激酶的酶活为25ug/u，反应缓冲液的ph值为8.0；其中pcr管盖上cas12a基因编辑酶的质量浓度为100ng/ul。

将上述混合好的含有核酸恒温扩增液的pcr离心管置于宏石荧光定量pcr仪slan96p，设置为37℃反应15分钟(不检测荧光)。

反应15分钟后经过小型掌上离心将pcr管盖上的cas12a基因编辑酶加入混合液中，置回荧光定量pcr仪并设置为37℃反应20分钟，fam通道每20s收集一次实时荧光。

反应结束后将上述含有反应液的pcr管拿到紫外灯下照射，并拍摄紫外透射的图像。

通过将荧光定量pcr仪收集到的荧光曲线与紫外透射的拍摄图像结果分析，发现两种模式得到的结果相一致，即待测样本与阳性对照均出现明显的荧光扩增曲线，同时紫外透射下呈现强烈的荧光，检测结果为阳性；而1份健康人的血清样本并未出现荧光扩增曲线，同时紫外透射下不发出任何荧光信号，检测结果为阴性。与实际用荧光定量pcr确诊的结果相一致，准确性好，检测快速，整个检测过程不需要开盖，杜绝了污染，真正实现了一室化、无污染、简单快速的核酸检测，是核酸检测优选的方法。

实施例四：阴道中人乳头瘤病毒hpv16型检测

准备1份人乳头瘤病毒hpv16型病毒培养液(已灭活)作为阳性对照，1份已用荧光定量pcr确诊的人乳头瘤病毒hpv16型感染的阴道样本，与1份健康人的阴道样本作为阴性对照。接着运用天根试剂盒病毒基因组dna/rna提取试剂盒(dp315)提取上述3组样本中的核酸，操作严格按照说明书描述的步骤。

将上述提取好的核酸2ul加入0.2mlpcr管中，同时在pcr管中加入44ul的核酸恒温扩增液，在pcr管盖上加入4ulcas12a基因编辑酶。所用的核酸恒温扩增液包含重组酶t4噬菌体uvsx蛋白，辅助蛋白t4噬菌体uvsy蛋白，单链结合蛋白gp32，dna聚合酶bsu，正向引物，反向引物，引导rna(crrna)，荧光探针以及反应缓冲液；反应缓冲液包括nacl，tris-hcl，mgcl2,mgac，dtt，聚乙二醇，乙酸钾，atp，dntps，磷酸肌酸，肌酸激酶。其中重组酶t4噬菌体uvsx蛋白的质量浓度为80ng/ul，辅助蛋白t4噬菌体uvsy蛋白的质量浓度为40ng/ul，单链结合蛋白gp32的质量浓度为220ng/ul，dna聚合酶bsu的质量浓度为200ng/ul，正向引物的摩尔浓度为0.4um，反向引物的摩尔浓度为0.4um，引导rna(crrna)的摩尔浓度为0.8um，荧光探针的摩尔浓度为0.2um；其中反应缓冲液的nacl的摩尔浓度为50mm，tris-hcl的摩尔浓度50mm，mgcl2的摩尔浓度为10mm,mgac的摩尔浓度为14mm，dtt的摩尔浓度为5mm，聚乙二醇的质量体积比为6％，乙酸钾的摩尔浓度为30mm，atp的摩尔浓度为12mm，dntps的摩尔浓度为2.2mm，磷酸肌酸的摩尔浓度为80mm，肌酸激酶的酶活为50ug/u，反应缓冲液的ph值为7.9；其中pcr管盖上cas12a基因编辑酶的质量浓度为80ng/ul。

将上述混合好的含有核酸恒温扩增液的pcr离心管置于宏石荧光定量pcr仪slan96p，设置为37℃反应15分钟(不检测荧光)。

反应15分钟后经过小型掌上离心将pcr管盖上的cas12a基因编辑酶加入混合液中，置回荧光定量pcr仪并设置为37℃反应20分钟，fam通道每20s收集一次实时荧光。

反应结束后将上述含有反应液的pcr管拿到紫外灯下照射，并拍摄紫外反射的图像。

通过将荧光定量pcr仪收集到的荧光曲线与紫外透射的拍摄图像结果分析，发现两种模式得到的结果相一致，即待测样本出现明显的荧光扩增曲线，同时紫外透射下呈现强烈的荧光，检测结果为阳性；而健康人的阴道样本并未出现荧光扩增曲线，同时紫外透射下不发出任何荧光信号，检测结果为阴性。与实际用荧光定量pcr确诊的结果相一致，准确性好，检测快速，整个检测过程不需要开盖，杜绝了污染，真正实现了一室化、无污染、简单快速的核酸检测，是核酸检测优选的方法。

实施例五：本发明方法与实时定量荧光pcr检测百日咳杆菌核酸质粒灵敏度的对比结果，

为对比本发明方法检测病毒核酸的灵敏度，准备百日咳杆菌核酸质粒is481分别稀释浓度为10⁷copies、10⁶copies、10⁵copies、10⁴copies、10³copies、10²copies、10¹copies与阴性对照。分别采用本发明方法与实时定量荧光pcr进行灵敏度的检测对比。

本发明的具体操作步骤见实施例一。

实时定量荧光pcr的操作包括以下步骤：取2ul对应浓度的质粒作为模板，加入pcr反应管中，同时加入已配好的pcr反应液。具体地，pcr反应液包括：文献j.med.microbiol(katrink.,etal.,evaluationofarealtimepcrassayfordetectionofbordetellapertussisandb.parapertussisinclinicalsamples.j.med.microbiol,issn0022-2615)发表的的0.3um上游引物bpf：atcaagcacagctttaccc；0.3um下游引物bpr：ttgggagttctggtaggtgtg；0.1um探针bpp：(fam)-aatggcaaggccgaacgcttca-(bhq1)；25ul2*taqmanmixture；灭菌纯化水补齐至50ul。

在abi7500或宏石slan96p荧光定量pcr仪上进行实时荧光定量pcr扩增。具体地，扩增程序包括：程序1.预变性95℃，10分钟循环数1；程序2.变性95℃，15秒钟与退火60℃，1分钟循环数40。

通过图6荧光曲线与荧光结果结果分析，本发明方法检测百日咳杆菌的最低检测浓度为10copies；而通过图7实时荧光定量pcr的检测结果分析，实时荧光定量pcr的最低检测浓度为10³copies。说明本发明在恒温下具有优于实时荧光定量pcr的高灵敏度，且整个检测过程缩短在1小时之内，对比实时荧光定量pcr的1小时40分钟用时更短，检测全程高度自动化。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。