用于HSV-1型和2型分型检测的组合物、试剂盒以及方法与流程

本发明属于分子生物学检测领域，更具体地，属于hsv-1和hsv-2分型检测领域。
背景技术：
：疱疹病毒是一种有包膜的线型双链dna病毒，目前发现了100多种，可以分为alpha、beta、gamma三大类(亚科)。其中，单纯疱疹病毒是一类严重危害人类健康、引起皮肤病和性病的常见病原体。单纯疱疹病毒基因组为线性dna分子，大小约152kb，由共价连接的长片段(μl)和短片段(us)组成，每一片段均含单一序列和反转重复序列。据估计，全球有37亿50岁以下的人(67％)罹患i型单纯疱疹病毒感染，有4.17亿人(11％)罹患ii型单纯疱疹病毒感染。根据血清学、流行病学的研究，hsv可分为1型单纯疱疹病毒(hsv-1)和2型单纯疱疹病毒(hsv-2)，都属于疱疹病毒alpha亚科。hsv-1与hsv-2病毒基因组具有相当大的同源序列，可高达50％。hsv-1主要引起眼、口、唇的皮肤和粘膜以及中枢神经系统的感染，产生疱疹性脑炎，疱疹性角膜炎等，少数引起生殖器疱疹；hsv-2感染外生殖器部位的皮肤粘膜，引起生殖器疱疹。生殖器疱疹具有长期潜伏性、彻底治愈难、病情反复发作等特点，给患者造成很大的身心负担。孕妇感染hsv的后果更为严重：妊娠早期感染hsv可引起流产、死产、死胎以及早产、畸形或智力低下；经产道及羊膜早破可引起感染新生儿，累及中枢神经系统，可引起新生儿疱疹等，甚至死亡，因此最有效的预防措施是开发灵敏、快速、准确的实验室诊断技术，提高无症状生殖器疱疹(genitalherpes，gh)妊娠妇女的筛查水平，在妊娠早期及晚期及时准确地诊断这类感染者，并采取积极防治措施，降低胎儿及新生儿的感染率，这对促进优生优育、提高人口出生质量具有重要的实际意义。我国的单疱病毒检测试剂较多，包括血液学检测和病毒学检查，血液学检测主要包括酶联免疫法、胶体金法、化学发光法，定性检测人血清或血浆中的单纯疱疹病毒1型或2型igg抗体亲和力。病毒学检测主要是病毒培养进行直接检测和hsv的dna检测。在血液学检测中也存在较多的问题：由于hsv-1和hsv-2抗体在疱疹感染早期可能尚未形成或滴度过低，因此在早期感染者中常出现假阴性结果，需通过重复实验或选用不同厂家试剂来进行确诊。由于非型特异性的hsv抗体检测在疱疹诊断中缺乏临床意义，因此应使用型特异性糖蛋白gg1和gg2的hsv血清学检测试剂。虽然蛋白印迹是疱疹诊断的金标准，其敏感性＞97％、特异性＞98％，但由于操作复杂且无商品化产品，因此只在少数科研机构能够完成该检测。直接检测病毒法是临床诊断和鉴定hsv感染最为可靠的方法，也是常规检测hsv的“金标准”方法。但是时间周期长，操作繁琐，需要专业的操作人员和严苛的试验条件，因此在快速临床诊断的方面应用很少。因此，检测hsvdna是快速临床诊断应用最多的方法。目前国内外已有荧光pcr诊断试剂盒在临床hsv感染诊断中使用，但是缺乏简单的核酸提取方法和完善的质控体系，并且其灵敏度都不高，大多在103拷贝/ml这一数量级，如中国专利公开cn101979667b，公开了一种hsv-1和hsv-2的荧光定量pcr分析方法，但其灵敏度仅为1000拷贝/ml。因此为了满足临床准确诊断的需要，本领域需要更高灵敏度，同时具有简单的核酸提取方法和完善的质控体系的产品。技术实现要素：有鉴于此，第一方面，本发明提供一种用于对hsv-1和hsv-2分析的引物和探针的组合物，所述组合物包括：第一组：如seqidno:1所示的hsv-1型上游引物、如seqidno:2所示的hsv-1型下游引物和如seqidno:3所示的hsv-1型探针；和下述第二组和第三组中的任一组：第二组：如seqidno:4所示的hsv-2型上游引物、如seqidno:5所示的hsv-2型下游引物和如seqidno:6所示的hsv-2型探针；第三组：如seqidno:7所示的hsv-2型上游引物、如seqidno:8所示的hsv-2型下游引物和如seqidno:9所示的hsv-2型探针；其中，hsv-1和hsv-2型探针的荧光报告基团互不相同且互不干涉。进一步地，在一个具体实施方案中，所述组合物包括：第一组：如seqidno:1所示的hsv-1型上游引物、如seqidno:2所示的hsv-1型下游引物和如seqidno:3所示的hsv-1型探针；和第二组：如seqidno:4所示的hsv-2型上游引物、如seqidno:5所示的hsv-2型下游引物和如seqidno:6所示的hsv-2型探针；其中，hsv-1和hsv-2型探针的荧光报告基团互不相同且互不干涉。使用本发明的组合物，一个样品只需进行一次核酸提取和一次pcr检测，就能得出hsv分型的检测结果。其方法简单，结果准确，且易于推广，同时本发明所述的引物和探针的灵敏度高，对于hsv-1和hsv-2检测的检测下限均低至4.00e+02拷贝/ml，并且不会受到其他常见种属相近的或引起症状相似的临床阳性样本(生殖器支原体、人型支原体、淋病奈瑟氏球菌(ng)、沙眼衣原体(ct)和hpv)的干扰，特异性好。在本发明中，所述hsv-1和hsv-1引物的靶标区域为hsv的ul27基因。ul27基因编码糖蛋白gb，其是在感染细胞中含量最多的糖蛋白，是感染宿主细胞免疫和体液免疫的主要靶标，也是hsv特定的细胞毒t淋巴细胞主要靶标。在本发明中，荧光报告基团可以互不干涉地选自fam、hex、rox、vic、cy5、5～tamra、tet、cy3和joe，但不限于此。在一个具体的实施方案中，hsv-1型探针的荧光报告基团为fam；hsv-2型探针的荧光报告基团为hex。在优选的实施方案中，所述本发明中的组合物还包括：用作内标检测的组合物。具体地，用作内标检测的组合物可包括内标上游引物、内标下游引物和内标探针。在一个实施方案中，内标上游引物具有seqidno:10所示的序列，内标下游引物具有seqidno:11所示的序列，内标探针具有seqidno:12所示的序列。进一步地，内标探针带有与其余探针不同的荧光报告基团，例如为cy5。也就是说，本发明的组合物可进一步包括内标引物以及内标探针。其可与本发明的组合物中的其它引物和探针联用且互不影响。内标引物和探针的使用能够判断本次检测是否有效，进一步确保所述组合物的检测准确性。在优选的实施方案中，第一组、第二组和第三组的引物和探针的浓度约为0.05～0.4μmol/l，更优选引物约为0.1μmol/l，探针约为0.05μmol/l。在优选的实施方案中，内标引物约为0.05μmol/l～0.4μmol/l，内标探针约为0.01μmol/l～0.1μmol/l，更优选引物约为0.1μmol/l，探针约为0.05μmol/l。在第二方面，本发明提供了上述组合物在制备对hsv-1和hsv-2型分型的试剂盒中的用途。在第三方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的组合物。进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、dntp、dna聚合酶、pcr缓冲液中的至少一种。进一步地，所述试剂盒还可以包括mg2+、糖基化酶、dutp。在一个具体的实施方案中，所述核酸释放试剂包括0.05～0.6mmol/l莎梵婷(surfactin)、50～300mmol/l氯化钾、质量/体积比为0.05％～3％十二烷基磺酸钠、体积/体积比为0.05％～2％乙醇等组分中的一种或几种。通过使用这种核酸释放试剂，不需要进行核酸提取，方法及其简单，不需要纯化离心也不需要高温加热，仅需要加入核酸释放试剂进行吹打即可，同时使得核酸释放非常完全，便于后续的pcr扩增操作，提高了检测的准确度。在具体的实施方案中，所述dna聚合酶为5u/μl～15u/μl；所述糖基化酶为0.05u/μl～0.2u/μl。通过设置尿嘧啶dna糖基化酶(ung酶)+dutp防污染体系，利用ung酶将可能存在的pcr产物污染充分降解，以排除由此可能引起的假阳性结果，使检测结果更准确。在第四方面，本发明提供了用于对hsv-1和hsv-2型分型的方法，所述方法包括以下步骤：1)提取待测样本的dna，所述样本优选为男性尿道拭子、女性宫颈拭子；2)使用上述本发明的组合物或试剂盒对步骤1)获得的dna进行荧光定量pcr检测；3)获得并分析结果。进一步地，提取待测样本的dna的方法为简单核酸释放剂方法。进一步地，荧光定量pcr检测的反应条件为：在一个具体的实施方案中，荧光定量pcr检测的反应条件为：附图说明图1为hsv-1的6套引物探针检测结果；图2为hsv-2的6套引物探针检测结果；图3为内标的3套引物探针检测结果；图4为4种引物和探针组合的hsv-1检测结果；图5为4种引物和探针组合的hsv-2检测结果；图6为hsv-1第1套引物不同浓度检测结果；图7为hsv-1第1套探针不同浓度检测结果；图8为hsv-2第6套引物不同浓度检测结果；图9为hsv-2第6套探针不同浓度检测结果；图10为内标第1套引物不同浓度检测结果；图11为内标第1套探针不同浓度检测结果；图12为本发明组合物特异性检测结果。具体实施方式下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。实施例1、本发明所使用的引物及探针设计应用dnastar软件包中的seqman和megalign软件对genbank中检索到的单纯疱疹病毒基因组序列进行同源性比较，针对ul27基因，找出型间特异且型内保守区段，在引物、探针设计软件primerexpress3.0和primerpremier5.0软件的辅助下，并通过genbank数据库中blast工具的检索分析，每型别设计出6套引物和对应的探针。同时，找出β-球蛋白基因保守区段，以相同方法针对β-球蛋白基因设计3套引物和对应的探针，其具体序列如表1-3所示。表1hsv-1组引物探针序列信息表2hsv-2引物探针序列信息表3gb引物探针序列信息其中，hsv-1的探针的荧光基团为fam；hsv-2的探针的荧光基团为hex；内标的探针的荧光基团为cy5。实施例2、本发明所使用的引物及探针筛选制备hsv-1和hsv-2的μl区域质粒，浓度1.00～5.00e+06拷贝/ml。取5μl的hsv-1和hsv-2型质粒分别与所设计的6套引物探针进行检测，pcr反应体系混合见表4、表5，上机检测，筛选较好的引物探针对。制备内标区域质粒，浓度1.00～5.00e+06拷贝/ml，取5μl的内标质粒分别与所设计的3套引物探针进行上机检测，筛选较好的引物探针。表4hsv-1pcr-mix反应液体系表5hsv-2pcr-mix反应液体系荧光pcr反应的过程如下所示(在荧光定量pcr扩增仪上进行)：1)将pcr反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称。2)荧光检测通道选择；3)荧光定量pcr反应条件为：反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析(也可以手动调节基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析)，然后记录样本ct值和定值结果。对于测定fam通道ct值≤39的样本，报告为hsv-1dna阳性；对于测定hex通道ct值≤39的样本，报告为hsv-2dna阳性；对于fam或hex通道测定ct值>39的样本，同时，内标cy5通道检测为阳性(ct值≤.39)，报告注明hsvdna低于试剂盒检测下限；若内标ct值>39或无显示，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复实验。hsv-1、hsv-2和内标的筛选结果如图1-3所示，发现hsv-1的第1套引物探针和第3套检测的ct差异不大，较其它4套靠前，hsv-2的第2套和第6套效果的ct差异不大，也较其它四套引物探针靠前，内标的3套引物探针对比，发现第一套引物探针效果最好。实施例3、本发明所使用的引物及探针的组合的筛选通过对hsv-1和hsv-2引物探针筛选，分别获得hsv-1的第1套和第3套引物探针，hsv-2的第2套和第6套引物探针，以及内标的第1套引物探针。因此将hsv-1和hsv-2的2对引物探针分别进行两两组合，获得4种组合方式，如表6所示。取浓度1.00～5.00e+06拷贝/ml，100倍稀释3个梯度，获得高中低浓度3个浓度梯度。分别取5μl的hsv-1和hsv-2型假质粒，与如表7所示的第1种组合方式pcr-mix作为示例，分别配置4组引物探针pcr-mix混合，上机检测，对比4种组合在各通道的扩增情况。表6引物探针4种组合方式序号组合方式1hsv-1第1套+hsv-2第2套2hsv-1第1套+hsv-2第6套3hsv-1第3套+hsv-2第2套4hsv-1第3套+hsv-2第6套表7引物探针第1种组合方式pcr-mix通过将hsv-1和hsv-2引物探针组合对高中低浓度进行检测，引物和探针组合的试验结果如图4-5所示，发现组合1和组合2对于hsv-1检测效果较好，组合2和组合4对于hsv-2的检测ct靠前，效果较好，因此综合hsv-1和hsv-2检测结果，筛选出组合2采用的是hsv-1第1套+hsv-2第6套的引物探针是最佳组合结果。实施例4、引物及探针浓度的筛选将获得最佳组合的引物探针采用如表8所示的不同浓度(0.05μmol、0.1μmol、0.2μmol和0.3μmol)的引物，探针浓度为0.05μmol，进行配制检测，获得最佳的引物浓度。在筛选获得最佳引物用量后，然后采用如表9所示的不同浓度(0.01μmol、0.05μmol、0.1μmol和0.2μmol)的探针，筛选出最佳的探针浓度。表8hsv-1的第1套引物的浓度筛选表9hsv-1的第1套探针的浓度筛选通过对引物和探针不同浓度进行筛选，对高中低浓度的质粒进行检测。如图6-11所示，hsv-1第1套检测结果发现0.1μmol/l的浓度比0.05μmol/l效果好，但是随着浓度的增加，ct值差异不大，因此获得hsv-1第1套引物浓度为0.1μmol/l，同样，采用不同浓度的探针进行配制，检测发现探针在0.01μmol/l时检测ct拖后，在0.05、0.1和0.2μmol/l的差异不大，因此探针浓度最佳为0.05μmol/l。同理，获得hsv-2第6套引物浓度为0.1μmol/l，探针为0.05μmol/l。内标引物浓度为0.1μmol/l，探针为0.05μmol/l。实施例5、不同核酸提取方法比较选取hsv-1和hsv-2高低浓度两个样本，平均分为4份，每份500μl，然后以下采用4种方法分别进行提取，提取后的核酸采用试剂盒进行检测。简单核酸释放剂：取500μl样本到1.5ml离心管，13000转离心5分钟，去上清，加入50μl核酸释放剂重悬并裂解10分钟，瞬时离心后作为待测样本备用。高温煮沸法：取500μl样本到1.5ml离心管，13000转离心5分钟，去上清，加入1ml的生理盐水，打散沉淀，100℃干预或者水浴10min，13000转离心5分钟，上清液用于pcr反应。(专利号cn109487014)试剂盒抽提法：严格按照商品化的qiaampdna抽提试剂盒操作，从临床标本中进行提取疱疹病毒的dna。(专利号cn103773898)圣湘生物的磁珠法：1.5ml离心管中依次加入300μldna提取溶液1，200μl样本、100μldna提取溶液2-mix，振荡混匀10s静置10min，瞬时离心后置于磁珠分离器吸附3min，吸弃废液，加入600μldna提取溶液3和200μldna提取溶液4，震荡混匀，瞬时离心，放置离心架上，从底部开始吸出废弃液，静置1min后完全吸弃残液，然后加入50μl的洗脱液，震荡混匀，放置5min，然后再放置磁力架上，取5μl样本用于检测。通过以上4个核酸提取方法，取5μl分别加入实施例2中的50μlpcr-mix，上机检测。表10hsv-1高低样本不同提取方法检测结果提取方法hsv-1阳性样本1hsv-1阳性样本2核酸释放剂19.1726.09煮沸法提取测试21.7427.08试剂盒抽提法20.1027.12磁珠法19.2126.10表11hsv-2高低样本不同提取方法检测结果提取方法hsv-2阳性样本1hsv-2阳性样本2核酸释放剂20.1527.17煮沸法提取测试22.7627.57试剂盒抽提法20.2527.46磁珠法19.8826.65通过采用不同提取方法进行探讨，发现四种检测方法差异均不是特别显著，而磁珠法检测与简单核酸释放剂效果稍好，但是煮沸法需要反复的离心和高温加热，核酸释放剂相对煮沸法具有浓缩的效果，因此检测ct值更加靠前。试剂盒以及磁珠法的操作方面也更为复杂，因此采用简单核酸释放剂方法既能保证核酸的提取质量也能提高核酸的检测率。实施例6、特异性分析以hsv-1、hsv-2阳性参考品p1、p2、阴性参考品n1～n8(n1～n2为正常人hsv-1、hsv-2阴性样本；n3～n8为种属相近的或引起症状相似的临床阳性样本，分别为生殖器支原体、人型支原体、ng、ct和hpv为待检样本，用质检合格的检测试剂盒在同一台slan-96仪器上检测，通过分析检测结果的阴阳性，考查试剂盒的特异性。实验结果如图6所示。由图12可以看出，hsv-1和hsv-2阳性参考品p1、p2，经质检合格的试剂检测均为阳性；hsv-1和hsv-2阴性参考品n1～n8经质检合格的试剂检测均为阴性，但内标均检测为阳性；生殖器支原体、人型支原体、ng、ct和hpv为待检样本经质检合格试剂检测，均为阴性。综上所述，本试剂盒具有很好的特异性。实施例7、灵敏度分析将已定值的hsv-1和hsv-2高浓度样本依次稀释至4.00e+06拷贝/ml、4.00e+05拷贝/ml、4.00e+04拷贝/ml、4.00e+03拷贝/ml、4.00e+02拷贝/ml、2.00e+02拷贝/ml，以所有稀释样本为待测样本，使用质检合格的检测试剂盒在同一台仪器上进行检测，其中4.00e+06拷贝/ml、4.00e+05拷贝/ml、4.00e+04拷贝/ml浓度的样本每个检测10次，4.00e+03拷贝/ml、4.00e+02拷贝/ml、2.00e+02拷贝/ml每个检测20次，分别与实施例2中的pcr反应液体系混合，上机检测，统计结果见表12、表13，确定本试剂盒的最低检测限。表12hsv-1最低检测限确认试验检测结果ct值统计表13hsv-2最低检测限确认试验检测结果ct值统计由上述表格可以看出，浓度为4.00e+02拷贝/ml及以上的样本阳性检出率为100％，而浓度为2.00e+02拷贝/ml的样本阳性检出率为75％。因此，确定本试剂盒的最低检测限为4.00e+02拷贝/ml。实施例8、干扰物质对检测的影响为考察样本中可能存在的干扰物质对检测结果的影响，分别选取2例临界浓度的hsv-1、hsv-2样本(400拷贝/ml)分成6等份，一份作为正常阳性对照，其余分别添加血红蛋白2g/l、尿液20％，4mg/ml的硝酸咪康唑、6mg/ml的洁尔阴泡腾片、10mg/ml的修正消糜栓等干扰物质后与干扰参考品f1(2g/l血红蛋白)、f2(20％尿液)作为待测样本，与正常阳性对照做对比，用质检合格的检测试剂盒在同一台仪器上检测，每个样本重复检测3次，评价试剂盒抗干扰的能力，结果如表14和15所示。表14干扰物质对hsv-1样本检测结果的影响表15干扰物质对hsv-2样本检测结果的影响由表14、表15可以看出，含各种干扰物质的hsv-1、hsv-2样本质检合格的检测试剂盒重复3次检测均为阳性，且与正常阳性样本平均ct值的差值小于0.5。因此，可以说明在本试剂实验条件下，样本中可能存在的干扰物质(2g/l血红蛋白、20％尿液、4mg/ml硝酸咪康唑、10mg/ml修正消糜栓、6mg/ml洁尔阴泡腾片)对试剂盒的检测结果无明显干扰。对比例1、与其他同类引物探针检测灵敏度的比较将已定值的hsv-1和hsv-2高浓度样本依次稀释至4.00e+03拷贝/ml、4.00e+02拷贝/ml、2.00e+02拷贝/ml，以所有稀释样本为待测样本，分别使用本发明引物探针，以及专利号cn104540967b所述引物探针(包括hsv-1pol和hsv-1tk核酸序列和hsv-2tk和hsv-2gb核酸序列的引物探针)配制反应体系，同时进行检测，每个浓度重复20次，比较检测灵敏度，统计结果如表16、表17所示：表16本发明hsv-1引物探针与hsv-1pol和hsv-1tk引物探针对比表17本发明hsv-2引物探针与hsv-2tk和hsv-2gb引物探针对比使用本发明引物探针与专利号cn104540967b所述引物探针(包括hsv-1pol和hsv-1tk核酸序列和hsv-2tk和hsv-2gb核酸序列的引物探针)，同时进行检测，在各浓度检测下，本发明的hsv-1和hsv-2引物探针均比专利号cn104540967b所述引物探针效果更好。当浓度为4.00e+03时，本发明的hsv-1和hsv-2引物探针与专利号cn104540967b所述引物探针检测检出率均为100％。而当浓度为4.00e+02时，本发明的hsv-1和hsv-2引物探针检测检出率为100％，而专利号cn104540967b所述引物探针检测检出率低于100％，以及当浓度为2.00e+02时，本发明的hsv-1和hsv-2引物探针阳性检出率也均高于专利号cn104540967b中所述引物探针。当前第1页1 2 3