同时检测多种RNA的方法与流程

本发明属于分子生物学和核酸化学领域，涉及一种同时检测多种rna的方法，具体为一种同时检测多种mirna和/或circrna的方法。

背景技术：

mirna是一种重要的非编码单链rna，含有约18-24个核苷酸，广泛存在于动植物细胞中，在许多生物过程中发挥着重要作用。越来越多的研究表明，约30％的人类基因表达和翻译受mirna的调控。此外，mirna的表达水平与不同肿瘤的发生发展有关。以mir-21为例，它是一种癌基因和抗凋亡指标，在乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胆管癌、胰腺癌、结直肠癌、胶质瘤、宫颈癌和肺癌中均有表达。因此，mirna成为肿瘤早期诊断、预后和治疗反应预测的最有前途的生物标志物之一。

circrna(环状rna)是一类具有闭合环状结构的非编码rna分子，没有5′帽子结构和3′poly(a)结构，主要位于细胞质或储存于外泌体中，不受rna外切酶影响，表达更稳定且不易降解，已被证明广泛存在于多种真核生物体内,具有组织特异性、疾病特异性、时序特异性及高稳定性等特征。近几年，大量的研究表明circrna在生物的生长发育、胁迫应答、疾病发生和发展等方面密切相关，并预测其在疾病诊断标记物等方面的应用前景。

然而现有技术中，并未见有效检测mirna和/或circrna的方法，尤其是同时检测多种mirna和/或circrna的方法。因此，研发一种同时检测多种mirna和/或circrna的方法显得很有必要。

技术实现要素：

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，提供一种同时检测多种rna的方法，其能对体系中多种mirna和/或circrna进行区分检测，并能对其进行定量检测，适用于广泛应用。

分子信标(mb)是一类具有发夹结构的dna探针，两端分别标记有一个荧光基团和一个猝灭集团。当荧光基团和猝灭基团接近时，荧光信号被猝灭。当发夹结构被打开或被切割时，荧光信号被激活。由于这种信号的转变很容易达到，因此，mb被广泛应用于许多研究领域。因此，本文设计了一种应用分子信标并且基于nease信号放大的检测mirna和/或circrna的方法。

本发明提供一种同时检测多种rna的方法，包括以下步骤：

1)设计catchprobe和reportprobe；

2)将步骤1)设计的catchprobe和reportprobe分别退火形成发卡结构；

3)加入步骤2)退火后的reportprobe、步骤2)退火后的catchprobe、rna酶抑制剂、nease和rna，孵育，然后对nease进行灭活，检测体系中的荧光信号。

所述nease为限制性核酸内切酶。

所述reportprobe和catchprobe根据靶标mirna设计且分别含有nease识别的双链序列中的一条。

reportprobe和catchprobe的设计原理及方法如图2所示，本领域技术人员可以根据mirna和/或circrna通过常规技术设计得到reportprobe和catchprobe。

catchprobe的5’端茎，与靶标mirna和/或circrna的一段互补配对，catchprobe的3’端茎与5’端茎互补，退火时可形成发夹结构。reportprobe的3’端茎与5’端茎互补，退火时可形成发夹结构，并且与catchprobe释放出的单链互补配对，reportprobe还包括nt.bsmai识别位点：碱基段gtctc。reportprobe的5’端和3’端分别用荧光基团和淬灭基团修饰。

根据本发明中的实施例，所述rna为mirna和/或circrna。

根据本发明中的实施例，所述步骤2)中，退火条件为：90～95摄氏度保持5分钟，随后每1分钟降温1摄氏度直至降到20～25摄氏度，优选地，所述步骤2)中，退火条件为：95摄氏度保持5分钟，随后每1分钟降温1摄氏度直至降到25摄氏度。

根据本发明中的实施例，所述步骤3)中，体系中reportprobe与catchprobe摩尔浓度比控制为7.5～8.5：1，所述步骤3)中，体系中reportprobe与catchprobe摩尔浓度比控制为8：1。

根据本发明中的实施例，所述步骤3)中，体系中nease的浓度控制为0.25～0.35u/μl，优选地，所述步骤3)中，体系中nease的浓度控制为0.3u/μl。

根据本发明中的实施例，所述步骤3)中，nease选用nt.bsmai，孵育条件为在35～40摄氏度下孵育40～60分钟。优选地，孵育条件为在37摄氏度下孵育50分钟。

根据本发明中的实施例，所述步骤3)中，使用hitachif-4600荧光分光光度计检测溶液中的荧光信号。

根据本发明中的实施例，所述步骤3)中，体系中reportprobe的浓度为45～55nm，catchprobe浓度为6.0～6.5nm。优选地，所述步骤3)中，体系中reportprobe的浓度为50nm，catchprobe浓度为6.25nm。由此，荧光信号最高。

根据本发明中的实施例，所述步骤3)中，所述rna酶抑制剂为ribonucleaseinhibitor，所述rna酶抑制剂的浓度控制为0.3～0.7u/μl，优选地，所述rna酶抑制剂的浓度控制为0.5u/μl。

根据本发明中的实施例，所述步骤3)中，体系使用的缓冲液为缓冲液，灭活温度为75～85摄氏度，灭活时间15～25分钟。优选地，灭活温度为80摄氏度，灭活时间20分钟。

所述缓冲液具体包括：50mm醋酸钾，ph＝7.9，100μg/mlbsa，20mm三醋酸钠，10mm醋酸镁。

所述的reportprobe和catchprobe根据靶标(mirna和/或circrna)设计且分别含有nease识别的双链序列中的一条，当单独形成发卡结构时不被nease识别切割，当catchprobe和reportprobe互补配对形成双链时，可以被nease识别并切割。

根据本发明中的实施例，mirna具体为mir-21时，其设计的reportprobe和catchprobe分别为catch-21和report-21，其中，

catch-21的序列为：

5’-ctgatgtt(gagac)ttttttcaacatcagacagataagcta-3’

report-21的序列为：

5’-/cy5/-gga(gtctc)aacatcactgactcc-/bhq/-3’

根据本发明中的实施例，mirna具体为mir-141时，其设计的catchprobe和reportprobe分别为catch-141和report-141，其中，

catch-141的序列为：

5’-gtaaaaccgt(gagac)tttttaacggttttaccagacagtgtta-3’

report-141的序列为：

5’-/cy5/-gga(gtctc)aacatcactgactcc-/bhq/-3’

根据本发明中的实施例，mirna具体为mir-199a时，其设计的catchprobe和reportprobe分别为catch-199a和report-199a，其中，

catch-199a的序列为：

5’-cattggtta(gagac)-3’

report-199a的序列为：

5’-/texasred/-ggt(gtctc)taaccaatctgacacc-/bhq/-3’

根据本发明中的实施例，mirna具体为mir-155时，其设计的catchprobe和reportprobe分别为catch-155和report-155，其中，

catch-155的序列为：

5’-gtgataggg(gagac)attttacccctatcacgattagcattaa-3’

report-155的序列为：

5’-/fam/-ggt(gtctc)ccctatcagtgacacc-/bhq/-3’

其中，下划线的部分为发卡结构的茎部分，括号部分为nt.bsmai识别位点。

所述的reportprobe标记有荧光基团和猝灭基团，形成二级结构后荧光信号猝灭。当与catchprobe形成双链后被nease切割断裂，释放出荧光信号。

本发明的检测原理如图1所示。靶标mirna能与catchprobe互补配对，配对部分长度覆盖并且大于catchprobe发夹结构的茎部分(序列下划线的部分)，因此打开catchprobe的发卡结构，释放出的单链部分，可以和reportprobe的环结构部分互补配对，配对部分长度覆盖并且大于reportprobe发夹结构的茎部分(序列下划线的部分)，并且形成双链结构含有可以被nease识别切割的序列，可以重新释放出catchprobe的单链部分，继续和reportprobe反应从而放大荧光信号。

本发明的有益效果在于：

1、本发明检测方法利用nease增强荧光信号，从而增强检测的灵敏度，降低检测下限，由此本发明检测方法的线性范围可达到1pm-100pm；

2、本发明检测方法可以对含有多种mirna的样品进行检测，并对多种mirna同时进行检测；

3、本发明检测方法还适用于其它新型的rna肿瘤标志物的检测。

附图说明

图1为本发明检测mirna和/或circrna的原理图；

图2为以mir-21为例，catchprobe和reportprobe的设计原理图；

图3为本发明检测方法检测不同浓度的mir-21的荧光信号图；

图4为本发明检测方法检测mir-21的工作曲线；

图5为本发明检测方法与qrt-pcr方法检测hela细胞和l02细胞中mir-21的含量的结果对比图；

图6为本发明检测方法检测含有多种mirna的样品的荧光信号图；

图7为验证是否形成环状rna的跑胶图；

图8为本发明检测方法检测不同浓度的新型肿瘤标志物circrna的荧光信号图；

图9为本发明检测方法检测不同浓度的新型肿瘤标志物circrna的工作曲线。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。以下实施例中，nease均选用nt.bsmai，rna酶抑制剂均选用ribonucleaseinhibitor(promega公司出售)。

reportprobe和catchprobe的设计原理及方法如图2所示，本领域技术人员可以根据mirna和/或circrna通过常规技术设计得到reportprobe和catchprobe。

catchprobe的5’端茎，与靶标mirna和/或circrna的一段互补配对，catchprobe的3’端茎与5’端茎互补，退火时可形成发夹结构。reportprobe的3’端茎与5’端茎互补，退火时可形成发夹结构，并且与catchprobe释放出的单链互补配对，reportprobe还包括nt.bsmai识别位点：碱基段gtctc。reportprobe的5’端和3’端分别用荧光基团和淬灭基团修饰。

实施例1

为了说明本发明可以检测mirna和/或circrna，本实施例以mir-21为示例，并用本发明检测方法对其进行检测，具体过程如下：

以mir-21(序列为5’-uagcuuaucugucugauguuga-3’)作为检测靶标。其中nease选用nt.bsmai，rna酶抑制剂选用ribonucleaseinhibitor(promega公司出售)，切割位点为双链dna中的5’-…gtctcn↓n…-3’

1、catch-21和report-21的设计合成(catch-21和report-21根据mir-21设计，设计原理及方法如图2所示，并人工合成)

catch-21的序列为：

5’-ctgatgtt(gagac)ttttttcaacatcagacagataagcta-3’

report-21的序列为：

5’-/cy5/-gga(gtctc)aacatcactgactcc-/bhq/-3’

其中，两端标下划线的部分为发卡结构的茎部分，括号部分为nt.bsmai识别位点。

2、mir-21的检测

(1)catch-21和report-21退火形成发卡结构

catch-21和report-21分别退火，95摄氏度保持5分钟，随后每1分钟降低1摄氏度直至降到25摄氏度。

(2)nease信号放大的检测mir-21的反应

配置50μl反应体系，体系中加入缓冲液、0.3u/μlnease，0.5u/μlrna酶抑制剂、50nmreport-21、6.25nmcatch-21以及一系列浓度梯度的mir-21(0pm、1pm、5pm、10pm、50pm、100pm、500pm、1nm、5nm、10nm、50nm)，37摄氏度孵育50分钟，之后80摄氏度灭活20分钟。

上述得到的产物使用hitachif-4600在625nm波长激发，检测体系中的荧光信号。结果如图3、4所示，由图中可知，本发明检测方法可检测到低至1pm的mir-21，随着mir-21浓度增加，荧光强度逐渐增强。mir-21浓度在一定范围内(具体为1pm-100pm)时，荧光信号与mir-21浓度的对数呈良好的线性关系，线性方程为y＝314.15-21.07x(y＝fluorescenceintensity，x＝-log(concentrationofmir-21(m))，r²＝0.975)。

由此可见，通过本发明检测方法对体系中mir-21实现定量检测，其检测限低至1pm。

实施例2

为了证明本发明检测方法的可靠性和准确性，本实施例用本发明检测方法对细胞totalrna中mir-21进行检测。其中，nease选用nt.bsmai，rna酶抑制剂选用ribonucleaseinhibitor(promega公司出售)。

检测过程如下：

1、细胞totalrna的提取

检测所用到细胞为mir-21高表达的宫颈癌细胞hela和mir-21低表达的正常肝细胞l02。

细胞totalrna的提取方法为约5×10⁶个消化掉的细胞加入1mltrizol试剂，室温孵育5分钟后12000g、4摄氏度离心5分钟。取悬浮液加入200μl氯仿，用手轻摇，室温孵育3分钟后12000g、4摄氏度离心15分钟，将上清水相转移到新的ep管中，加入500μl异丙醇，室温孵育10分钟，12000g、4摄氏度离心10分钟，移去上清加入1ml75％的冰乙醇，混匀，7500g、4摄氏度离心5分钟。移去上清，空气干燥后加入20μl无酶水，nanodrop定量，放入-80摄氏度冰箱保存。

2、totalrna中mir-21的检测

从上述细胞提取出3μg进行实验。用本发明检测方法对样品进行检测，检测发现mir-21在癌细胞hela中为高表达，在正常细胞l02中为低表达。

进一步地，为了验证本发明检测方法定量的准确性，运用qrt-pcr分析方法对hela和l02细胞提取物样本中mir-21进行分析，结果表明这两种方法测得的结果基本一致。实验结果如图5所示。

由此可见，本发明检测方法可以可靠、准确地测量实际样本中mirna的含量。

实施例3

为了验证本发明检测方法可以同时检测不同的mirna和/或circrna，本实施例用本发明检测方法对含有不同种类mirna的多个混合样品进行了检测。其中，nease选用nt.bsmai，rna酶抑制剂选用ribonucleaseinhibitor(promega公司出售)。检测过程如下：

1、本实验中用到的序列如表1所示其中，catch-21、report-21为根据mir-21设计并人工合成的catchprobe和reportprobe，设计方法如上所述；catch-141、report-141根据mir-141设计并人工合成的catchprobe和reportprobe，设计方法如上所述；catch-199a、report-199a根据mir-199a设计并人工合成的catchprobe和reportprobe，设计方法如上所述；catch-155、report-155根据mir-155设计并人工合成的catchprobe和reportprobe，设计方法如上所述。

表1实施例3所用序列

两端标下划线的部分为发卡结构的茎部分，括号部分为nt.bsmai识别位点。

2、混合样品的组成分别如表2所示

表2混合样品sample0～sample15的组成

3、混合样品sample0～sample15的检测

report-21、report-141、report-155、report-199a、catch-21、catch-141、catch-155、catch-199a分别退火。配置多个50μl反应体系，反应体系中含有缓冲液、0.3u/μlnt.bsmai,50nmreport-21、report-141、report-155、report-199a,6.25nmcatch-21、catch-141、catch-155、catch-199a,0.5u/μlrna酶抑制剂。

分别向反应体系中加入混合样品sample0～sample15在37摄氏度下孵育50分钟，之后在80摄氏度灭活20分钟，分别得到反应产物。

上述反应产物分别使用hitachif-4600检测荧光信号。其中mir-21即cy5激发波长625nm，发射波长670nm；mir-141即cy3激发波长535nm，发射波长570nm；mir-199a即texasred激发波长585nm，发射波长620nm；mir-155即fam激发波长488nm，发射波长520nm。结果如图6所示。结果显示，本发明检测方法对混合样品中不同mirna有较好的区分作用，本发明检测方法能同时检测出混合样品中不同mirna。

实施例4

为了说明本发明检测方法可以对新型肿瘤标志物进行检测，本实施例以一种circrna为例，用本发明检测方法对其进行检测，其中，nease选用nt.bsmai。具体过程如下：

新型肿瘤标志物circrna的检测

1、本实验中用到的序列如下：

linearhas_circ_0067699：5’-phosphate-cugauaagcuaucacugcuaggucuauuuaguggagcccaaguacuccgcgcuaggucaacaucagu-3’

primerdna：5’-gatagcttatcagactgatgttga-3’

形成的circrna后识别序列5’-caacaucagucugauaagcuauca-3’(序列如seqidno.13所示)

其设计的catchprobe和reportprobe分别为catch-circ和report-circ，序列分别如下：

catch-circ：5’-ctgataag(gagac)ttgatagcttatcagactgatgttg-3’(序列如seqidno.14所示)

report-circ：5’-/fam/-gga(gtctc)cttatcacttgactcc-/bhq/-3’(序列如seqidno.15所示)

两端标下划线的部分为发卡结构的茎部分，括号部分为nt.bsmai识别位点。

2、circrna的合成

circrna一般由5’磷酸化的线性rna合成，具体步骤为primerdna与5’磷酸化的线性rna(linearhas_circ_0067699)经过退火互补配对，在t4rnaligase2的作用下形成环状的circrna，由于rnaser可以特异性的消化线性rna而不会消化环状rna，因此用rnaser来检测linearrna是否成环。反应后体系添加rnaser和不添加rnaser分别跑胶，跑胶图如图7所示，由图可知，反应后体系添加rnaser和不添加rnaser跑胶，跑胶图中均有circrna的条带，由此可见，反应得到了目标circrna。反应液中的primerdna用dnasei去除。

3、circrna的检测

catch-circ、report-circ分别退火，配置50μl反应体系，含有缓冲液、0.3u/μlnt.bsmai,50nm退火后的report-circ,6.25nm退火后的catch-circ，以及一系列浓度梯度的circrna(0pm、100pm、500pm、1nm、5nm、10nm、50nm)在37摄氏度下孵育50分钟，之后80摄氏度灭活20分钟。

上述反应产物使用hitachif-4600检测荧光信号，激发波长488nm，发射波长520nm。结果如图8所示。结果表明该方法可以适用于新型肿瘤标志物circrna的检测。图9为本发明检测方法检测不同浓度的新型肿瘤标志物circrna的工作曲线，由图可知，circrna浓度在一定范围内时，荧光信号与mir-21浓度的对数呈良好的线性关系，线性方程为y＝272.96-20.92x(y＝fluorescenceintensity，x＝-log(concentrationofcircrna(m))，r²＝0.951)。由此可见，本发明检测方法可以对circrna实现定量检测。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

序列表

<110>武汉大学

<120>同时检测多种rna的方法

<160>15

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

uagcuuaucugucugauguuga22

<210>2

<211>40

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ctgatgttgagacttttttcaacatcagacagataagcta40

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ggagtctcaacatcactgactcc23

<210>4

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

uaacacugucugguaaaaccgu22

<210>5

<211>43

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gtaaaaccgtgagactttttaacggttttaccagacagtgtta43

<210>6

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

ggagtctcacggtttaatgactcc24

<210>7

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

acaguagucugcacauugguua22

<210>8

<211>43

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

cattggttagagaccttttactaaccaatgtgcagactactgt43

<210>9

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

ggtgtctctaaccaatctgacacc24

<210>10

<211>23

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

uuaaugcuaaucgugauaggggu23

<210>11

<211>42

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

gtgataggggagacattttacccctatcacgattagcattaa42

<210>12

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

ggtgtctcccctatcagtgacacc24

<210>13

<211>24

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

caacaucagucugauaagcuauca24

<210>14

<211>38

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

ctgataaggagacttgatagcttatcagactgatgttg38

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<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>15

ggagtctccttatcacttgactcc24