用于HSV-1基因编辑的指导RNA及其方法与流程

本文公开的实施方案涉及基因编辑领域，特别是涉及用于1型单纯疱疹病毒(hsv-1)的cas9介导的基因编辑的人工指导rna(grna)。还公开了通过使用所述grna进行的cas9介导的基因编辑方法。

背景技术：

1、1型单纯疱疹病毒(hsv-1；按分类学名称也被称为人类单纯疱疹病毒1型)是疱疹病毒科单纯疱疹病毒属中的双链dna病毒。hsv-1含有152,000个核苷酸。在过去的几十年中，hsv-1已经被修饰以产生用于治疗癌症的各种溶瘤病毒。其中，重组hsv-1病毒株orienx010(icp34.5-/-，icp47-，icp6-)是正在进行的临床试验中的溶瘤病毒，其包括在原始icp34.5基因处插入两个拷贝的人gm-csf基因和未公开的在icp6基因内的失活修饰。

2、crispr/cas9介导的同源重组被用于改进hsv-1的基因编辑，特别是用于基因插入(dong wang et al.(2018),cancer gene ther.,25(5-6):93-105)。然而，由于各种hsv-1突变体之间的差异，现有的基因编辑方法不能应用于所有种类的hsv-1突变体。特别地，使用crispr/cas9系统编辑所述hsv-1突变体orienx010的经修饰icp6基因区域是不容易实现的。

3、目前还需要开发用于上述hsv-1突变体类型的高效的基因编辑方法。

技术实现思路

1、本文公开的实施方案涉及包含指导序列的指导rna(grna)，所述指导序列能够将cas9蛋白靶向1型单纯疱疹病毒(hsv-1)的icp6基因中的靶序列以提供特异性切割事件，其中与野生型hsv-1相比，所述靶序列包含gatc插入。

2、一些实施方案涉及编码如上所述的grna的第一多核苷酸。

3、一些实施方案还涉及载体，所述载体包含可操作地连接至合适的启动子的如上所述的第一多核苷酸，并且任选地还包含编码cas9蛋白的第二多核苷酸。

4、一些实施方案还涉及包含如上所述的一种载体和含有编码cas9蛋白的第二多核苷酸的第二载体的载体系统。

5、一些实施方案还涉及用如上所述的载体或载体系统转化的转化体细胞，其能够表达grna和cas9蛋白。

6、一些实施方案还涉及包含如上所述的grna和cas9蛋白的cas9/grna复合物。

7、一些实施方案还涉及用于hsv-1的基因编辑系统，其包括：

8、(a)包含icp6基因中的靶序列的hsv-1病毒株，其中所述靶序列与野生型hsv-1相比包含gatc插入；

9、(b)如上所述的载体或载体系统，其能够表达grna和cas9蛋白；以及

10、(c)靶向多核苷酸，其按顺序包含上游同源臂、外源基因和下游同源臂，其中所述上游同源臂和下游同源臂分别与所述hsv-1的靶结构域的5’区和3’区同源，其中所述靶序列位于所述hsv-1的靶结构域内。

11、本发明还涉及用于产生重组hsv-1的基因编辑方法，其包括以下步骤：

12、(a)提供hsv-1病毒株，其中所述hsv-1病毒株包含icp6基因中的靶序列，并且所述靶序列与野生型hsv-1相比包含gatc插入；

13、(b)构建如上所述的载体或载体系统，其能够表达grna和cas9蛋白；

14、(c)制备包含靶向多核苷酸的线性dna，所述靶向多核苷酸能够通过同源重组将外源基因插入所述hsv-1的靶结构域中；

15、(d)将所述载体或载体系统转化到细胞中以获得第一转化体细胞；

16、(e)将线性dna转化到第一转化体细胞中以获得第二转化体细胞；

17、(f)用hsv-1病毒株感染第二转化体细胞，以在第二转化体细胞中引起crispr/cas9介导的同源重组的发生，其中grna将cas9蛋白靶向靶序列以提供特异性切割事件，然后通过同源重组将外源基因插入靶结构域。

18、本发明还涉及通过上述基因编辑方法产生的重组hsv-1。

技术特征：

1.一种指导rna(grna)，其包含能够将cas9蛋白靶向1型单纯疱疹病毒(hsv-1)的icp6基因中的靶序列以提供切割事件的指导序列，其中与野生型hsv-1相比，所述靶序列包含gatc插入。

2.根据权利要求1所述的grna，其中所述icp6基因表达通过插入gatc序列引起的失活的icp6蛋白。

3.根据权利要求1所述的grna，其中所述icp6基因是失活的icp6基因。

4.根据权利要求1所述的grna，其中所述icp6基因包含对应于seq id no.17的核苷酸25-64的序列。

5.根据权利要求1所述的grna，其中所述icp6基因包含seq idno.17。

6.根据权利要求5所述的grna，其中所述靶序列是选自对应于seq id no.17的核苷酸25-64的序列范围的20个核苷酸的序列。

7.根据权利要求5所述的grna，其中所述靶序列包含选自seqid no.17的20个核苷酸的序列。

8.根据权利要求5所述的grna，其中所述靶序列包含选自seqid no.18、19、20、21、22和23的序列。

9.根据权利要求5所述的grna，其中所述靶序列选自seq idno.18、19、20、21、22和23。

10.根据权利要求5所述的grna，其中所述靶序列是seq idno.21。

11.根据权利要求1所述的grna，其中所述指导序列包含选自seq id no.24、25、26、27、28和29的序列。

12.根据权利要求1所述的grna，其中所述指导序列是选自seqid no.24、25、26、27、28和29的序列。

13.根据权利要求1所述的grna，其中所述指导序列是seq idno.27。

14.一种第一多核苷酸，其编码根据权利要求1-13中任一项所述的grna。

15.一种载体，其包含与合适的启动子可操作地连接的根据权利要求14所述的第一多核苷酸。

16.根据权利要求15所述的载体，其进一步包含编码cas9蛋白的第二多核苷酸。

17.一种载体系统，其包含根据权利要求15所述的一种载体和包含编码cas9蛋白的第二多核苷酸的第二载体。

18.一种用根据权利要求16所述的载体或根据权利要求17所述的载体系统转化的转化体细胞，其能够表达grna和cas9蛋白。

19.根据权利要求18所述的转化体细胞，其是vero细胞。

20.一种cas9/grna复合物，其包含根据权利要求1-13中任一项所述的grna、和cas9蛋白。

21.一种用于hsv-1的基因编辑系统，其包括：

22.一种用于产生重组hsv-1的基因编辑方法，其包括以下步骤：

23.根据权利要求22所述的基因编辑方法，其中所述icp6基因包含seq id no.17。

24.根据权利要求22所述的基因编辑方法，其中所述靶序列包含选自seq id no.18、19、20、21、22和23的序列。

25.根据权利要求22所述的基因编辑方法，其中所述靶序列选自seq id no.18、19、20、21、22和23。

26.根据权利要求22所述的基因编辑方法，其中所述靶序列是seq id no.21。

27.根据权利要求22所述的基因编辑方法，其中步骤(c)中的所述靶向多核苷酸按顺序包含上游同源臂、所述外源基因和下游同源臂；其中所述上游同源臂和所述下游同源臂分别与所述hsv-1的靶结构域的5’区和3’区同源，其中所述靶序列位于所述hsv-1的靶结构域内。

28.根据权利要求27所述的基因编辑方法，其中所述上游同源臂包含seq id no.12。

29.根据权利要求27所述的基因编辑方法，其中所述下游同源臂包含seq id no.13。

30.一种重组hsv-1，其通过根据权利要求22所述的基因编辑方法产生。

技术总结
本发明提供了指导RNA(gRNA)，其包含能够将Cas9蛋白靶向1型单纯疱疹病毒(HSV‑1)的ICP6基因中的靶序列以提供特异性切割事件的指导序列，其中与野生型HSV‑1相比，所述靶序列包含GATC插入。还提供了通过使用所述gRNA产生所需重组HSV‑1的HSV‑1基因编辑系统和基因编辑方法。

技术研发人员：李晓明,舒骁,贾茹,王宁
受保护的技术使用者：北京奥源和力生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13