一种对样本中DNA和RNA分子进行标记并同时检测的方法与流程

一种对样本中dna和rna分子进行标记并同时检测的方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，特别是基因测序领域。具体地，本发明涉及对同一样本中dna和rna分子同时测序的方法。更具体地，本发明涉及基于dna分子和rna分子混合体系构建测序文库的方法，确定dna和rna分子的序列信息的方法，以及确定转录复合体中正在转录的dna目标区域和合成的rna分子的序列信息的方法。


背景技术：

2.dna和rna测序数据的整合分析有助于探索正常表型和疾病中的遗传学特征。除了用于计算基因的表达量之外，rna测序数据还可以对dna上的碱基变异数据进行平行验证。例如，在癌症中，大约三分之一的位于编码区域的体细胞单核苷酸变异(snvs)也可以在rna数据中观察到，为筛选真实变异位点提供了生物学过滤方法。此外，dna和rna数据整合分析对于分析基因表达调控差异、rna编辑和等位基因特异性表达等十分有用，对于分析疾病样本等十分重要。
3.目前，大多数的dna和rna整合分析实验是对于样本进行平行的dna和rna测序，这一策略需要很长的文库准备时间，并可能由于样本异质性而造成分析的偏差。已有的单细胞整合测序方法g&t-seq和dr-seq在全基因组范围内发现了细胞水平上拷贝数和表达之间的相关性。然而，由于目前单细胞测序方法固有的批次效应和覆盖率问题，这些新方法在需要更全面的基因组和转录组的情况下效用有限。此外，这两种方法仍然需要分别构建dna和rna测序文库，不能准确地保留样本中dna和rna分子的物理关联信息。simul-seq可以对组织样本中提取的dna和rna样本同时进行文库构建，但是其步骤依赖于tn5酶对dna的打断和接头连接，以及rna连接酶1只能连接单链的特性来对rna分子进行区分，这种方法会有5’末端的偏差，而且不能够区分单链dna和rna分子。同时由于tn5加接头的过程会打断dna，simul-seq也不适用于短片段的dna和rna分子混合样本，比如从血浆中提取的cfdna和cfrna混合物，而这种样本对于进行癌症筛查、癌症辅助诊断和术后跟踪等具有重要的意义。
4.因此，仍然需要改进和发明新的同时生产dna和rna测序数据的方法，以便对血浆等样本进行全面的基因组和转录组分析。


技术实现要素：

5.具体地，本发明通过如下各项技术方案解决现有技术中存在的上述技术问题。
6.1.一种用于构建测序文库的方法，其包括以下步骤：
7.(1)在dna和rna分子的混合样本中的所述rna分子的3’末端连接特异性标签接头；
8.(2)利用逆转录引物，基于连接有所述标签接头的rna分子，获得单链dna分子；和
9.(3)对样本中所有dna分子进行文库构建。
10.2.一种对样本中dna和rna分子进行同时测序的方法，其包括以下步骤：
11.(1)在dna和rna分子的混合样本中的所述rna分子的3’末端连接特异性标签接头；
12.(2)利用逆转录引物，基于连接有所述标签接头的rna分子，获得单链dna分子；
13.(3)对所述样本中所有dna分子进行文库构建；和
14.(4)对文库进行测序，并利用所述标签接头的序列来区分所述混合样本中的rna分子。
15.3.根据项1或2所述的方法，其中，步骤(1)的连接反应的连接酶是截断型t4 rna连接酶2或其点突变体。
16.4.根据项1-3中任一项所述的方法，其中，步骤(3)所使用的文库构建方法包括：
17.(a)将所述dna分子变性处理为单链；
18.(b)在步骤(a)得到的所述单链的3’末端和/或5’末端连接特异性接头；和
19.(c)任选地使用扩增引物进行扩增，所得扩增产物即为测序文库。
20.5.根据项1-3中任一项所述的方法，其中，步骤(3)所使用的文库构建方法包括：
21.(a)将步骤(2)得到的单链dna分子延伸成双链dna；
22.(b)在步骤(a)得到的所述双链dna的一端或两端连接双链接头；和
23.(c)使用扩增引物进行扩增，所得扩增产物即为测序文库。
24.6.根据项4所述的方法，其还包括：
25.(d)将步骤(b)得到的产物延伸成双链dna；和
26.(e)在步骤(d)得到的所述双链dna的一端或两端连接双链接头；和
27.(f)使用扩增引物进行扩增，所得扩增产物即为测序文库。
28.7.根据项2-6中任一项所述的方法，其中，步骤(4)所使用的测序方法包括使用二代高通量测序或三代测序。
29.8.一种用于构建同一样本中的dna和rna分子的测序文库的试剂盒，其包括：
30.rna末端连接模块，其包括特异性标签接头且用于将所述标签接头连接在所述rna分子的3’末端；
31.逆转录模块，其包含逆转录引物和逆转录酶且用于以连接有所述标签接头的rna分子为基础产生dna分子；
32.dna文库构建模块，其用于将样本中的dna分子构建成测序文库。
33.9.根据项8所述的试剂盒，其中，所述rna末端连接模块中包括连接酶，优选地所述连接酶为截断型t4 rna连接酶2或其点突变体。
34.10.一种在dna和rna分子的混合样本中确定dna和rna分子的序列信息的方法，其包括：
35.基于所述dna和rna分子的混合样本，通过根据项1所述的方法构建测序文库；
36.对所述测序文库进行测序，以获得测序结果；以及
37.基于所述测序结果，确定所述dna和rna分子的混合样本中dna和rna分子的序列信息。
38.11.一种确定dna和rna分子的序列信息的系统，其包括：
39.根据项8或9所述的试剂盒；
40.测序装置，其用于对通过所述试剂盒对样本构建的所述测序文库进行测序，获得所述样本的测序结果；和
41.分析装置，对所述样本的测序结果进行分析，以获得所述dna和rna分子的序列信
息。
42.12.一种用于确定转录复合体中正在转录的dna目标区域和合成的rna分子的序列信息的方法，其包括：
43.将样本中染色质进行随机打断，以获得长度为200bp-500bp的染色质样本；利用rna聚合酶的抗体对所述染色质样本进行免疫共沉淀，使用蛋白酶k降解掉蛋白质后，获得正在转录区域的双链dna和rna样本；
44.对所述双链dna和rna样本，通过根据项1和3-7中任一项所述的方法构建测序文库；对所述测序文库进行测序；基于测序结果，确定所述正在转录的dna目标区域和合成的rna分子的序列信息。
45.13.通过根据项1-7、10和12中任一项所述的方法，其中，所述样本含有细胞游离dna和细胞游离rna。
附图说明
46.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
47.图1显示了根据本发明一个实施例的对同一样本中dna和rna分子同时测序的方法的流程示意图；
48.图2显示了根据本发明的一个实施例构建的dna/rna混合文库的片段大小质检图。
49.发明详述
50.除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。
[0051]“基因测序”是指通过一定的技术分析手段分析dna或者rna片段中的碱基序列的排列方式，从而为生物学和医学的研究发现提供支持。
[0052]“测序文库”是指用于基因测序的某物种或样本中全部dna或rna随机片段的集合。
[0053]
dna(即，脱氧核糖核酸)是指生物细胞内携带有合成rna和蛋白质所必需的遗传信息的一种核酸，是生物体发育和正常运作必不可少的生物大分子。dna是由脱氧核糖核苷酸组成的大分子聚合物。脱氧核糖核苷酸由碱基、脱氧核糖和磷酸构成。其中碱基有4种，分别是腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)和胸腺嘧啶(t)。rna(即，核糖核酸)是指生物细胞、部分病毒、类病毒内的遗传信息载体。rna是由核糖核苷酸组成的大分子聚合物。核糖核苷酸由碱基、核糖和磷酸构成。其中碱基有4种，分别是腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u)。
[0054]
dna或rna的5’端是指dna或rna单链带有游离5
’‑
羟基或其磷酸酯的末端。dna或rna的3’端dna或rna单链带有游离3
’‑
羟基或其磷酸酯的末端。将rna分子与特异性标签接头连接是指将特异性标签接头连接在rna分子的3’末端。本发明的特异性标签接头是指任何能够与rna分子的3’末端连接的短的核酸序列。在一个实施方案中，该接头为通过截断型的t4 rna连接酶2或其点突变体与rna分子的3’末端连接的短的核酸序列。所述酶只能够将腺苷化的单链dna或rna接头连接到rna分子的3’末端，而不能连接到dna分子的3’末端，从而实现了对rna分子的特异连接。在一个实施方案中，该接头在5’端具有腺苷化修饰，且在3’端具有双脱氧修饰，从而防止了连接反应中接头的自连和dna和rna分子间的自连。在一
个实施方案中，该接头的5’端还可引入n个任意碱基的序列，用于矫正低起始量建库时可能引起的pcr扩增误差，其中n可为1-15的正整数。特异标签接头的序列可为例如，5
’‑
rapp-(n)ntgatgcgtagccttaa-3’ddc。在一个实施方案中，所述连接可在包含如下反应体系中进行：dna和rna分子样本，特异性标签接头，截断型t4 rna连接酶2。在一个实施方案中，所述反应体系还包含连接酶反应缓冲液，peg8000和rna酶抑制剂。在一个实施方案中，dna和rna分子样本经过热变性处理。在一个实施方案中，所述连接可在如下反应条件下进行：16℃过夜或者25℃反应2小时或者37℃反应30分钟。
[0055]
逆转录是指以rna为模板合成dna的过程，即rna指导下的dna合成。此过程中的核酸合成方向和遗传信息的流动方向(rna到dna)均与转录过程(dna到rna)相反，故称为逆转录。逆转录是在逆转录酶的作用下，以dntp为底物，以rna为模板，在逆转录引物的3
’‑
末端上按5
’→3’
方向延伸，合成一条与rna模板互补的cdna单链，它与rna模板形成rna-cdna杂交体。随后又在逆转录酶的作用下，水解掉rna链，再以cdna为模板合成第二条dna链。至此，完成由rna指导的dna合成过程。逆转录引物可采用随机引物或基因特异性的引物。在一个实施方案中，逆转录引物是根据本发明的特异性标签接头的已知序列设计的序列，其可为例如5
’‑
gttaaggctacgcatca-3’(其中以粗体表示的序列为特异性标签接头序列的反向互补序列)。在一个实施方案中，所述逆转录可在包含如下的反应体系中进行：连接有特异性标签接头的rna分子，逆转录引物和逆转录酶。在一个实施方案中，所述反应体系还包含逆转录酶缓冲液和rna酶抑制剂。在一个实施方案中，所述逆转录的温度可根据逆转录酶的最优反应温度确定。在一个实施方案中，所述逆转录可如下反应条件下进行：42℃反应30分钟。在一个实施方案中，可对逆转录的产物进行纯化，例如采用磁珠法进行纯化。在一个实施方案中，可对纯化的逆转录产物进行脱磷酸处理。在一个实施方案中，所述脱磷酸处理可在包含碱性磷酸酶的反应体系中进行。在一个实施方案中，所述反应体系还可包含反应缓冲液。在一个实施方案中，所述脱磷酸处理可在如下条件下进行：37℃30分钟和95℃5分钟，得到dna单链。
[0056]
将单链接头与上步所得的dna单链连接是指将单链接头连接在上步所得的dna单链的3’末端和/或5’末端。本发明的单链接头是指任何能够与dna单链的3’末端和/或5’末端连接的短的核酸序列。在一个实施方案中，该接头在5’端具有磷酸化修饰，且在3’端具有双脱氧修饰，从而防止了连接反应中接头的自连和dna分子间的自连。在一个实施方案中，该接头的5’端还可引入n个任意碱基的序列，用于矫正低起始量建库时可能引起的pcr扩增误差，其中n可为1-15的正整数。单链接头的序列可为例如，5
’‑
pho-(n)naagtcggatcgtagccatg-3’ddc。在一个实施方案中，所述连接可在包含如下反应体系中进行：上步所得的dna单链，单链接头，t4 rna连接酶。在一个实施方案中，所述反应体系还包含连接酶反应缓冲液和peg8000。在一个实施方案中，所述连接可在如下反应条件下进行：16℃过夜或者30℃反应2小时。
[0057]
延伸是以逆转录得到的dna单链或上步得到的连接产物为模板，利用延伸引物进行延伸，获得双链dna产物的过程。在一个实施方案中，延伸引物是根据本发明的单链接头已知序列设计的序列，其可为例如5
’‑
caactccttggctcacagaacgacatggctacgatccgactt-3’(其中以粗体表示的序列为单链接头序列的反向互补序列)。在一个实施方案中，所述延伸可在包含如下的反应体系中进行：逆转录得到的dna单链或上步得到的连接产物，延伸引物
和dna聚合酶。在一个实施方案中，所述反应体系还包含dna聚合酶缓冲液。在一个实施方案中，所述延伸可在如下反应条件下进行：95℃2分钟，45℃30秒，72℃5分钟。
[0058]
双端接头连接是指将双链dna接头与上步得到的双链dna产物连接的过程。与双链dna分子连接的双链接头在本发明中是指任何能够与所得的双链dna分子连接的短的双链核酸序列。在一个实施方案中，所述接头由f序列和r序列组成，其中r序列是f序列的反向互补。在一个实施方案中，r序列的最后还有一个多出的碱基t。在一个实施方案中，所述双链接头的f序列和r序列可分别为例如，5
’‑
pho-gaagtcggaggccaagcggtcttaggaagacaa-3’和5
’‑
caactccttggctcacagaacgacatggctacgatccgacttct-3’(粗体表示f序列与r序列的反向互补区)。在一个实施方案中，所述双端接头连接可在包含如下反应体系中进行：上步所得的双链dna产物，双链dna接头，t4 rna连接酶。在一个实施方案中，所述反应体系还包含t4 dna连接酶缓冲液。在一个实施方案中，所述连接可在如下反应条件下进行：20℃反应30分钟。
[0059]
第二代高通量测序是指采用微珠或高密度芯片一边合成一边测序的技术，其优点是测序通量高，可一次获得数g数据，但需要通过扩增来放大测序信号。第三代测序是指通常采用纳米材料对单链dna/rna直接用合成、降解、通过纳米孔等方式直接测序的单分子测序技术，其优点是无需扩增，因成本更低。
[0060]
本发明中的扩增或pcr扩增是指：将含有所需扩增分析序列的靶dna双链在高温处理一段时间形成两个寡聚核苷酸单链(解链)，加入一对根据已知dna序列由人工合成的与所扩增的dna两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为扩增引物，即正向和反向引物。引物在较低温度与两个dna单链接触一段时间以分别互补结合(退火)，并在较高温度和dna聚合酶的作用下，以靶dna单链为模板，以4种单核苷酸(dntps)为原料，按5’到3’方向延伸一段时间，从而合成新的dna双链(延伸)。然后又开始再一次的解链-退火-延伸的循环，从而将极微量的靶dna特异地扩增上百万倍或更多(即，扩增产物)。在一个实施方案中，本发明的扩增是利用pcr引物，基于本发明的双端连接反应得到的产物，合成pcr反应产物。pcr引物是根据本发明的双链dna接头序列中r序列的5’端和f序列的3’端已知序列设计的序列。在一个实施方案中，所述正反向引物中可存在一定个数的随机碱基用于在高通量测序中区分不同的样本。所述正反向引物分别可为，例如：正向引物5
’‑
gcatggcgaccttatcagnnnnnnnnnnttgtcttcctaagaccgcttgg-3’(其中以粗体表示的序列为f序列的反向互补序列)和反向引物5
’‑
pho-ctctcagtacgtcagcagttnnnnnnnnnncaactccttggctcacagaac-3’(其中以粗体表示的序列为r序列的5’序列)，其中存在10个随机碱基用于在高通量测序中区分不同的样本。在一个实施方案中，所述pcr扩增可在包含如下的反应体系中进行：双端连接反应得到的产物，正向引物，反向引物和dna聚合酶。在一个实施方案中，所述dna聚合酶是高保真dna聚合酶。在一个实施方案中，所述反应体系还包含dna聚合酶缓冲液。在一个实施方案中，所述pcr扩增可在如下反应条件下进行：98℃2分钟；然后是98℃15秒、60℃30秒和72℃30秒的8-30个、优选8-20个、更优选8-15个循环；然后72℃反应5分钟。在一个实施方案中，用磁珠法对pcr产物进行纯化。
[0061]
为了解决上述现有技术中存在的技术问题，本发明的目的，在于提出一种操作简单，高灵敏性，适于微量样品和血浆样本的dna和rna同时测序方法。该方法可以避免现有技术混淆单链dna分子和rna分子的问题，同时对核酸5’和3’的末端偏好性低，并且能够保留
dna和rna分子的末端序列信息。
[0062]
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
[0063]
根据本发明的一个方面，提供了一种对于同一样本中的dna和rna分子进行测序的方法，该方法包括以下步骤：
[0064]
(1)在dna和rna分子混合样本中的rna分子的3’末端连接特异性标签接头；
[0065]
(2)利用逆转录引物，基于所述连接有标签接头的rna分子，获得单链dna分子；
[0066]
(3)对体系中所有dna分子进行文库构建；
[0067]
(4)对文库进行测序，并利用连接有特异性标签接头的序列来区分混合样本中的rna分子。
[0068]
利用根据本发明实施例的对同一样本中dna和rna分子同时测序的方法，能够有效地构建同一样本中dna和rna分子的测序文库，特别是能够有效地构建血浆中的cfdna/cfrna样本的测序文库。利用截断型t4 rna连接酶2将rna的3’末端连接上特异标签接头，能避免标签接头连接到单链dna的3’端上的情况，减小了测序数据的偏差。同时在将rna反转为单链dna后，后续的建库流程可选择使用一管式反应流程，减少了建库起始量，进而能够高效、灵敏地应用于高通量测序技术，基于对测序结果的数据分析，就能够有效地获得dna和rna的序列信息。
[0069]
所述dna和rna混合样本可以从任何途径获得，核酸样本的来源包括但不限于生物体、器官、组织、细胞和细胞器等。在某些实施例中，所述样本含有细胞游离dna和细胞游离rna。
[0070]
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种构建同一样本中的dna和rna分子的测序文库的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：rna末端连接模块，所述连接模块包括用于连接在单链rna的3’末端的特异性标签接头；逆转录模块，所述逆转录模块与所述rna末端连接模块相连，所述逆转录模块包含逆转录引物和逆转录酶，用于基于上一步连接有特异性标签接头的rna分子通过逆转录获得单链dna分子；和dna文库构建模块，所述dna文库构建模块与逆转录模块相连，用于将体系中的dna分子构建成测序文库。
[0071]
根据本发明的另一方面，提供了利用根据本发明实施例的用于构建同一样本中的dna和rna分子的测序文库的试剂盒，能够利用微量单链dna和rna混合样品进行测序文库的构建，并且可以区分dna和rna分子，样品损失少，序列信息保持完整，且能应用于血浆提取的cfdna和cfrna混合样本的文库的构建。
[0072]
根据本发明的又一方面，提供了一种在dna和rna分子的混合样本中确定dna和rna分子的序列信息的方法，根据本发明的实施例，该方法包括：基于dna和rna分子的混合样本，根据本发明所述方法构建测序文库；对所述测序文库进行测序，以获得测序结果；以及基于所述测序结果，确定混合样本中dna和rna分子的序列信息。
[0073]
根据本发明的又一方面，提供了一种确定dna和rna分子序列信息的系统。根据本发明实施例，该系统其包括：测序文库构建装置，所述测序文库构建装置可为本发明所述的试剂盒；测序装置，所述测序装置与所述测序文库构建装置相连，以对所述样本的测序文库进行测序，获得所述样本的测序结果；分析装置，对所述样本的测序结果进行分析，以获得所述dna和rna分子的序列信息。
[0074]
采用根据本发明实施例的确定dna和rna分子的序列信息的系统，能够灵敏、准确、
高效地确定微量样本中的dna和rna的序列信息，并且可以保留二者的物理关联信息。
[0075]
根据本发明的另一方面，提供了一种用于确定转录复合体中正在转录的dna目标区域和合成的rna分子的序列信息的方法，根据本发明的实施例，其包括：将染色质进行随机打断，以便获得长度为200bp-500bp的染色质样本；利用rna聚合酶的抗体对所述染色质样本进行免疫共沉淀，使用蛋白酶k降解掉蛋白质后，获得正在转录区域的双链dna和rna样本；对所述双链dna和rna样本，通过根据本发明所述的方法构建测序文库；对所述测序文库进行测序；基于测序结果，确定所述正在转录区域的dna和rna分子的序列信息。
[0076]
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
实施例
[0077]
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。本领域的技术人员将会理解，下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或者仪器未注明生产厂商者，都是可以通过商业市场购买获得的常规产品，例如neb等公司。
[0078]
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种对同一样本中dna和rna分子同时测序的方法。参考图1，根据本发明的实施例，该方法可包括以下步骤：
[0079]
1.用于建库的dna和rna样本首先用qubit 4.0来进行定量，分别使用1*qubit dsdna hs测定试剂盒和qubit microrna测定试剂盒来进行定量。对于建库的dna部分可用0.5-20ng作为起始量，对于建库的rna部分可用100pg-10ng作为起始量。
[0080]
2.将rna分子与特异性标签接头相连。
[0081]
2-1将dna和rna分子样本与特异性标签接头混合，70℃反应2分钟，然后使用连接酶在连接反应体系中进行连接。
[0082]
2-2特异性标签接头的序列是5
’‑
rapp-(n)ntgatgcgtagccttaa-3’ddc，该接头序列的5’端具有腺苷化修饰，3’端具有双脱氧修饰，防止了连接反应中接头的自连和dna和rna分子间的自连。同时在接头的5’端引入n个碱基的随机序列，用于矫正低起始量建库时可能引起的pcr扩增误差，n为1～15的正整数。
[0083]
2-3该连接反应的连接酶是截断型的t4 rna连接酶2以及其各种点突变体，该酶只能够将腺苷化的单链dna或rna接头连接到rna分子的3’末端，而不能连接到dna分子的3’末端，从而实现了对rna分子的特异连接。
[0084]
2-4连接反应体系包括：2-1得到的热变性产物，特异性标签接头，截断型t4 rna连接酶2，连接酶反应缓冲液，peg8000和rna酶抑制剂。
[0085]
2-5反应条件为16℃过夜或者25℃反应2小时或者37℃反应30分钟。
[0086]
3.利用逆转录引物，基于所述具有标签接头的rna分子，获得单链dna分子。
[0087]
3-1以上一步得到的连接产物为模板，根据标签接头已知序列设计逆转录引物进行逆转录，获得单链dna分子。
[0088]
3-2逆转录引物序列为5
’‑
gttaaggctacgcatca-3’[0089]
3-3逆转录反应体系包括2-5得到的连接产物，逆转录引物，逆转录酶缓冲液，逆转
录酶和rna酶抑制剂。
[0090]
3-4反应条件根据逆转录酶的最优反应温度决定。
[0091]
4.采用磁珠法进行逆转录产物的纯化。
[0092]
5.脱磷酸处理和高温变性。
[0093]
将4得到的纯化产物进行脱磷酸处理，反应体系中包括碱性磷酸酶和反应缓冲液，37℃反应30分钟，然后95℃反应5分钟，将dna高温变性成单链。
[0094]
6将单链接头与5得到的单链dna产物连接，该连接为两个单链dna分子之间的连接。
[0095]
6-1单链接头序列为5
’‑
pho-(n)naagtcggatcgtagccatg-3’ddc,该接头序列5’端磷酸化修饰，3’端双脱氧修饰，防止了连接反应中接头的自连和dna分子间的自连。同时在接头的5’端引入n个碱基的随机序列，用于矫正低起始量建库时可能引起的pcr扩增误差，n为1～15的正整数。
[0096]
6-2该连接反应体系包括：5得到的单链dna产物，单链接头，peg8000，连接酶缓冲液和t4 rna连接酶。
[0097]
6-3反应条件为16℃过夜或者30℃反应2小时。
[0098]
7延伸反应。以5得到的单链dna产物或6-3得到的连接产物为模板，根据单链接头已知序列设计引物进行延伸，获得双链dna产物。
[0099]
7-1引物序列为：5
’‑
caactccttggctcacagaacgacatggctacgatccgactt-3’[0100]
7-2反应体系包括：5得到的单链dna产物或6-3得到的单链dna连接产物，引物，dna聚合酶缓冲液和dna聚合酶。
[0101]
7-3反应条件：95℃2分钟，45℃30秒，72℃5分钟。
[0102]
8.双端接头连接。该步反应是7-3得到的的双链dna产物和双链dna接头之间进行的分子间连接。
[0103]
8-1双链dna接头序列为：
[0104]
f序列：5
’‑
pho-gaagtcggaggccaagcggtcttaggaagacaa-3’[0105]
r序列：5
’‑
caactccttggctcacagaacgacatggctacgatccgacttct-3’[0106]
r序列是f序列的反向互补，特殊的是，r序列的最后有一个突出的碱基t。
[0107]
8-2连接反应体系包括：7-3得到的双链dna产物，双链dna接头，t4 dna连接酶和t4 dna连接酶缓冲液。
[0108]
8-3反应条件为20℃反应30分钟。
[0109]
9.pcr扩增。以8-3得到的连接产物为模板，根据双链dna接头序列中r序列的5’端和f序列的3’端已知序列设计正反向引物，进行pcr扩增，所述正反向引物中可引入一定个数的随机碱基用于在高通量测序中区分不同的样本。
[0110]
9-1合成正向和反向pcr引物
[0111]
正向引物序列：
[0112]5’‑
gcatggcgaccttatcagnnnnnnnnnnttgtcttcctaagaccgcttgg-3’[0113]
反向引物序列：
[0114]5’‑
pho-ctctcagtacgtcagcagttnnnnnnnnnncaactccttggctcacagaac-3’[0115]
其中的10个随机碱基用于在高通量测序中区分不同的样本。
[0116]
9-2反应体系包括：上步连接产物，正反向pcr引物，高保真dna聚合酶，dna聚合酶缓冲液。
[0117]
9-3反应条件：98℃变性2分钟；98℃，15秒，60℃，30秒，72℃，30秒。该过程循环反应8-15个循环。然后72℃反应5分钟。
[0118]
10.磁珠法进行pcr产物纯化，得出目的产物，回收得到文库。
[0119]
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。