编辑碱基的融合蛋白及其应用

本发明属于生物，具体涉及一种编辑碱基的融合蛋白及其应用。本发明还涉及编码所述编辑碱基的融合蛋白的多核苷酸，包含所述多核苷酸的重组表达载体，包含前述融合蛋白、多核苷酸或重组表达载体的碱基编辑系统及药物组合物。

背景技术：

1、自2013年以来，以crispr/cas9为代表的新一代基因编辑技术进入生物学领域的各个实验，改变了传统的基因操作手段。2016年4月，david liu实验室首次报导了基于胞嘧啶脱氨酶与crispr/cas9融合的可在dna上实现c到t或g到a的cbe单碱基编辑工具。2017年10月，david liu实验室再次报导了基于胞嘧啶脱氨酶与crispr/cas9融合的可在dna上实现a到g或t到c的abe单碱基编辑工具。

2、单碱基基因编辑技术，已被报道可用于高效地进行基因组的基因突变或修复、疾病动物模型制作、基因治疗。其中，不同改进版本的cbe，如提高效率的cbemax、能识别特定序列的ea3a-be3、缩窄窗口的ye1-be3、拓宽窗口的be-plus、提高靶向靠近pam区编辑效率的hycbe等。而对于abe而言，虽然也有提高效率的abemax、缩窄窗口的abe7.10f148a，但其它版本的改进进展缓慢。提高靶向靠近pam区编辑效率的abe，由于腺苷脱氨酶兼容性差的原因，超高活性的abe未见报道。另外，基于胞嘧啶脱氨酶、腺苷脱氨酶两种脱氨酶与crispr/cas9融合的双功能碱基编辑器a&c-bemax，由于腺苷脱氨酶的活性有所损失，导致其两种碱基同时编辑的效率低，限制了a&c-bemax的广泛应用。

3、目前abe在靠近pam区编辑效率低下。另外，基于胞嘧啶脱氨酶、腺苷脱氨酶两种脱氨酶与crispr/cas9融合的双功能碱基编辑器a&c-bemax，其a/c两种碱基同时编辑的效率最高为30％，效率仍然较低。一定程度上限制了abe和a&c-bemax的广泛应用。

4、因此，开发一种通用的超高活性的abe和a&c-bemax也是本领域的迫切需要。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺少高的近pam区编辑效率的腺嘌呤碱基编辑器以及缺少高的同时编辑腺嘌呤和胞嘧啶的碱基编辑器的不足，提供一种编辑碱基的融合蛋白及其应用。本发明的融合蛋白不仅可以有效提高近pam区的编辑效率，并拓宽了编辑窗口；还有效提高了a/c同时编辑效率。

2、发明人依据自己的先前研究策略，在现有的腺嘌呤碱基编辑器中融合rad51的dna结合结构域(rad51 dbd)，经过不同rad51 dbd的融合位点和腺嘌呤碱基编辑器的筛选尝试，发现rad51 dbd与abemax进行融合，几乎失去a到g的编辑效率；而rad51dbd与abe8e进行融合，则在特定融合位点融合可以得到超高活性的腺嘌呤碱基编辑器，有效提高近pam区的编辑效率，并拓宽了编辑窗口。此外，采用相似的策略在编辑腺嘌呤和胞嘧啶的碱基编辑器(a&c-bemax)中融合rad51 dbd，其a/c同时编辑效率并未得到有效提高；因此，发明人尝试将腺嘌呤脱氨酶进行改进(将tada-tada*换成tada8e)，发现其a/c同时编辑效率得到了有效提高，进一步融合rad51 dbd，获得了具有超高活性的编辑腺嘌呤和胞嘧啶的碱基编辑器。

3、本发明通过以下技术方案解决上述技术问题：

4、本发明的第一方面提供一种编辑腺嘌呤的融合蛋白，所述融合蛋白的n端至c端依次包括tada8e片段和cas9n片段，所述tada8e片段的氨基酸序列如seq id no:1所示，所述cas9n片段为具有单链切割活性的cas9蛋白片段；

5、所述融合蛋白还包括rad51片段，所述rad51片段与所述cas9n片段相邻并位于所述cas9n片段的n端或c端；所述rad51片段的氨基酸序列如seq id no:2所示。

6、本发明中，所述rad51片段为rad51的dna结合结构域(dna binding domain)，所述rad51为来源于人的具有dna断裂修复的蛋白质。

7、在本发明一些实施方案中，所述融合蛋白还包括核定位信号片段，所述核定位信号片段位于所述融合蛋白的n端和/或c端。

8、在本发明一些具体实施方案中，所述核定位信号片段的氨基酸序列如seq id no:3所示。

9、本发明中，所述核定位信号是指促进蛋白质进入细胞核(例如通过核转运)的氨基酸序列，为本领域公知。

10、在本发明一些实施方案中，所述cas9n片段的来源选自spcas9、sacas9、nmecas9、stcas9、cjcas9或其突变体组成的组。

11、在本发明一些较佳实施方案中，所述cas9n片段的来源为spcas9。

12、在本发明一些具体实施方案中，所述cas9n片段的氨基酸序列如seq id no:4所示。

13、本发明中，所述cas9n片段是cas9蛋白具有核酸剪切功能的片段或其突变体。优选地，所述cas9蛋白可以是来源于酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)的cas9蛋白(spcas9)、金黄色葡萄球菌(streptococcus aureus)的cas9蛋白(sacas9)、脑膜炎奈瑟氏球菌(neisseria meningitides)的cas9蛋白(nmecas9)、嗜热链球菌(streoticiccystgerniogukys)的cas9蛋白(stcas9)或空肠弯曲杆菌(campylobacter jejuni)的cas9蛋白(cjcas9)。

14、本发明中，tada8e是腺嘌呤脱氨酶，能够移除腺嘌呤分子中的氨基。

15、在本发明一些具体实施方案中，所述融合蛋白的所述核定位信号片段位于融合蛋白的n端和c端，所述cas9n片段的来源为spcas9。

16、本发明的第二方面提供一种编辑腺嘌呤和胞嘧啶的融合蛋白，所述融合蛋白的n端至c端依次包括haid片段、tada8e片段和cas9n片段，所述haid片段的氨基酸序列如seqid no:5所示，所述tada8e片段的氨基酸序列如seq id no:1所示，所述cas9n片段为具有单链切割活性的cas9蛋白片段。

17、在本发明一些实施方案中，所述融合蛋白还包括rad51片段，所述rad51片段与所述cas9n片段相邻并位于所述cas9n片段的n端；所述rad51片段的氨基酸序列如seq id no:2所示。

18、在本发明一些较佳实施方案中，所述cas9n片段为如第一方面所述的融合蛋白的cas9n片段。即，所述cas9n片段的来源选自spcas9、sacas9、nmecas9、stcas9、cjcas9或其突变体组成的组。优选地，所述cas9n片段的来源为spcas9。更优选地，所述cas9n片段的氨基酸序列如seq id no:4所示。

19、在本发明一些实施方案中，所述融合蛋白还包括ugi片段，和/或核定位信号片段。

20、在本发明一些较佳实施方案中，所述ugi片段位于所述cas9n片段的c端；所述核定位信号片段位于所述融合蛋白的n端和/或c端。

21、在本发明一些更佳实施方案中，所述ugi片段包括两个拷贝，每个拷贝优选具有如seq id no:6所示的氨基酸序列。所述核定位信号片段的氨基酸序列如seq id no:3所示。

22、本发明中，haid为胞嘧啶脱氨酶，能够移除胞嘧啶分子中的氨基。

23、本发明的第三方面提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如第一方面或第二方面所述的融合蛋白。

24、本发明中，所述多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。dna可以是编码链或非编码链。

25、本领域公知，由于密码子的简并性，有大量多核苷酸序列可以编码相同的融合蛋白。另外，不同物种对于密码子具有一定的偏好性，可能会根据在不同物种中表达的需要，会对所述融合蛋白的密码子进行优化，这些变体均在本发明所述多核苷酸的保护范围内。

26、本发明的第四方面提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含如第三方面所述的多核苷酸。

27、本发明中，所述重组表达载体进行重组的载体可为本领域常规的能在宿主细胞内稳定表达的载体，例如细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒等。

28、本发明的第五方面提供一种碱基编辑系统，所述碱基编辑系统包括：碱基编辑器和sgrna；所述碱基编辑器包含如第一方面或第二方面所述的融合蛋白。

29、本发明中，所述sgrna具有与所述碱基编辑器中的cas9n蛋白结合并将其引导至目的基因的功能。所述sgrna在其5’端具有与所述目的基因互补的序列，并通过该互补的序列与所述目的基因结合，从而将本发明的碱基编辑器引导至所述目的基因。

30、所述目的基因中含有pam序列，所述pam序列是指可由cas9n蛋白识别的序列。

31、本发明的第六方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包含如第一方面或第二方面所述的融合蛋白、或者如第五方面所述的碱基编辑系统。

32、本发明的第七方面提供一种非治疗目的的碱基编辑方法，所述碱基编辑方法包括通过如第一方面或第二方面所述的融合蛋白、如第三方面所述的多核苷酸、如第四方面所述的重组表达载体、或如第五方面所述的碱基编辑系统在靶细胞中进行碱基编辑。

33、在本发明一些实施方案中，所述靶细胞为原核细胞或真核细胞。

34、本发明中，所述原核细胞可为本领域公知的微生物细胞，优选具有医疗研究价值、工业生产价值的微生物细胞。

35、在本发明一些较佳实施方案中，所述真核细胞为动物细胞或植物细胞。

36、本发明中，所述动物细胞可为哺乳动物细胞、啮齿类动物细胞，包括人、马、牛、羊、鼠、兔等。

37、本发明中，所述非治疗目的例如在实验室中通过检测靶细胞发生的编辑来评价本发明所述的编辑腺嘌呤的融合蛋白、编辑腺嘌呤和胞嘧啶的融合蛋白或相应的碱基编辑系统。反之，也可以通过碱基编辑研究靶细胞的功能。

38、本发明中，所述碱基编辑方法还可以是治疗目的的。本发明中，所述治疗是指治疗受试者例如人类的疾病，包括抑制所述疾病的发生或发展、缓解所述疾病的症状或治愈所述疾病。

39、本发明的第九方面提供如第一方面或第二方面所述的融合蛋白、如第三方面所述的多核苷酸、如第四方面所述的重组表达载体、如第五方面所述的碱基编辑系统、或者如第六方面所述的药物组合物在制备碱基编辑试剂、构建动物模型中的应用。

40、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

41、本发明所用试剂和原料均市售可得。

42、本发明的积极进步效果在于：

43、本发明的编辑腺嘌呤的融合蛋白可以有效提高近pam区的编辑效率，并拓宽了编辑窗口；本发明的编辑腺嘌呤和胞嘧啶的融合蛋白有效提高了a/c同时编辑效率。