检测淋病奈瑟菌RNA核酸序列的恒温扩增引物对、探针、试剂盒及方法与流程

本申请涉及生物，尤其涉及检测淋病奈瑟菌rna核酸序列的恒温扩增引物对、探针、试剂盒及方法。

背景技术：

1、淋病奈瑟菌(neisseria gonorrhoeae，ng)属革兰阴性球菌，为严格的人体寄生菌。ng可引起人类泌尿生殖系统化脓性感染(俗称淋病)。流行病学调查结果显示，淋病在性传播疾病中一直是最常见、且为排列第一位的疾病。淋病奈瑟菌感染与年龄、性别、种族、受教育程度、性行为方式和机体免疫力有关，也受社会、文化和经济等因素影响。人体感染淋病奈瑟菌初期常为无症状性淋病，如果不及时治疗便会引起严重的泌尿生殖道疾病。尤其是女性患者常导致盆腔炎症性疾病和继发不孕。所以及时、准确地诊断淋球菌感染已成为治疗淋病的关键。

技术实现思路

1、本申请实施例的目的在于提出一种检测淋病奈瑟菌rna核酸序列的恒温扩增引物对、探针、试剂盒及方法，能够快速准确检测ng rna。

2、为了解决上述技术问题，本申请实施例提供一种检测淋病奈瑟菌rna核酸序列的恒温扩增引物对和探针，采用了如下所述的技术方案：

3、一种检测淋病奈瑟菌rna核酸序列的恒温扩增引物对和探针，所述恒温扩增引物对包括所述目的引物对和内标引物对，所述探针包括目的探针和内标探针，所述目的引物对包括ng rna上游引物seq id no：1和ng rna下游引物seq id no：2，所述目的探针为ngrna探针seq id no：3，所述内标引物对包括外源性内标上游引物seq id no：4和外源性内标下游引物seq id no：5，所述内标探针为外源性内标探针seq id no：6；

4、进一步的，所述ng rna上游引物seq id no：1的序列从5’-3’为 actcggcaaattgataccgtaacttcgggaga，所述ng rna下游引物seq id no：2 的序列从5’-3’为ctttcgtgttggcaagagtgctcgtgtttt，所述ng rna探针seq id no：3从5’-3’为gagaaggtatgccctctaaggttaaggactt(fam)-thf-ct (bhq1)ccgtaagccccggagg，所述外源性内标上游引物seq id no：4的序列从5’-3’为agctgtcactcccgtaagacatcagggttc，所述外源性内标下游引物 seq id no：5的序列从5’-3’为ttgctctgataattctactaattttccagt，所述外源性内标探针seq id no：6的序列从5’-3’为 cggtagttgttgggcattctcggccgtt(hex)gc-thf-act(bhq2)gtagagggaataaat。

5、进一步的，所述seq id no：3核苷酸序列的第31个碱基标记有fam、第 33个碱基标记有bhq1，31-32bp之间添加thf残基，3’端g加入阻断基团，所述seq id no：6核苷酸序列的第28个碱基标记有hex、第33个碱基标记有bhq2，30-31bp之间添加thf残基，3’端t加入阻断基团。

6、为了解决上述技术问题，本申请实施例还提供一种检测淋病奈瑟菌rna 核酸序列的试剂盒，采用了如下所述的技术方案：

7、一种检测淋病奈瑟菌rna核酸序列的试剂盒，所述试剂盒包括ng rna反应液a，所述ng rna反应液a包括引探混合物，所述引探混合物包括如权利要求1所述的检测淋病奈瑟菌rna核酸序列的恒温扩增引物对和探针。

8、进一步的，所述ng rna反应液a还包括atp、dntps和三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。

9、进一步的，所述试剂盒还包括ng rna反应液b、ng rna反应液c、ng rna 内标溶液、ng rna消化反应液和质控品。

10、进一步的，所述ng rna反应液b包括rpa mix。

11、进一步的，所述质控品包括阴性质控品和阳性质控品，所述阴性质控品包括生理盐水，所述阳性质控品包括ng培养物。

12、进一步的，ng rna反应液c包括激活剂，所述ng rna消化反应液包括 dna酶i，所述ng rna内标溶液包括含内标片段的假病毒。

13、为了解决上述技术问题，本申请实施例还提供一种使用上述的试剂盒检测淋病奈瑟菌rna核酸序列的方法，采用了如下所述的技术方案：

14、一种使用上述的试剂盒检测淋病奈瑟菌rna的方法，包括：

15、制备扩增体系溶液，所述扩增体系溶液通过ng rna反应液a和ng rna 反应液b制备；

16、提取待测样本的核酸，向各所述扩增体系溶液中分别加入经dna消化及灭活处理后的ng rna阴性质控品、ng rna阳性质控品和待测样本的核酸，并向各所述扩增体系溶液中均加入ng rna反应液c，获得对应的反应总体系溶液；

17、将反应总体系溶液离心后上机检测，获得检测结果。

18、与现有技术相比，本申请实施例主要有以下有益效果：

19、本试剂盒与ng dna检测试剂盒相比，具有灵敏度更高，特异性更强，更不容易污染实验室环境的优势，而且由于rna在活体菌中可以较为稳定存在，一旦菌体死亡或者rna游离于菌体外部则会很快降解，因此，以ng rna作为检测标记物，能够有效鉴别活体病原体，假阳性少，检测周期大幅缩短，有利于临床药物治疗及治疗后疗效评估。本申请可检测尿液及多种分泌物。尿液获取无创、方便以及误差小。一份样本一次检测过程只需20min，相对于已有的荧光pcr检测技术，大大缩短检测所需时间。

技术特征：

1.一种检测淋病奈瑟菌rna核酸序列的恒温扩增引物对和探针，其特征在于，所述引物对包括目的引物对和内标引物对，所述探针包括目的探针和内标探针，所述目的引物对包括ng rna上游引物seq id no：1和ng rna下游引物seq id no：2，所述目的探针为ng rna探针seq id no：3，所述内标引物对包括外源性内标上游引物seq id no：4和外源性内标下游引物seq id no：5，所述内标探针为外源性内标探针seq id no：6。

2.根据权利要求1所述的检测淋病奈瑟菌rna核酸序列的恒温扩增引物对和探针，其特征在于，所述ng rna上游引物seq id no：1的序列从5’-3’为actcggcaaattgataccgtaacttcgggaga，所述ng rna下游引物seq id no：2的序列从5’-3’为ctttcgtgttggcaagagtgctcgtgtttt，所述ng rna探针seq id no：3从5’-3’为gagaaggtatgccctctaaggttaaggactt(fam)-thf-ct(bhq1)ccgtaagccccggagg，所述外源性内标上游引物seq id no：4的序列从5’-3’为agctgtcactcccgtaagacatcagggttc，所述外源性内标下游引物seq id no：5的序列从5’-3’为ttgctctgataattctactaattttccagt，所述外源性内标探针seq id no：6的序列从5’-3’为cggtagttgttgggcattctcggccgtt(hex)gc-thf-act(bhq2)gtagagggaataaat。

3.根据权利要求1所述的检测淋病奈瑟菌rna核酸序列的恒温扩增引物对和探针，其特征在于，所述seq id no：3核苷酸序列的第31个碱基标记有fam、第33个碱基标记有bhq1，31-32bp之间添加thf残基，3’端g加入阻断基团，所述seq id no：6核苷酸序列的第28个碱基标记有hex、第33个碱基标记有bhq2，30-31bp之间添加thf残基，3’端t加入阻断基团。

4.一种检测淋病奈瑟菌rna核酸序列的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括ng rna反应液a，所述ng rna反应液a包括引探混合物，所述引探混合物包括如权利要求1所述的检测淋病奈瑟菌rna核酸序列的恒温扩增引物对和探针。

5.根据权利要求4所述的检测淋病奈瑟菌rna核酸序列的试剂盒，其特征在于，所述ngrna反应液a还包括atp、dntps和三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液。

6.根据权利要求4所述的检测淋病奈瑟菌rna核酸序列的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括ng rna反应液b、ng rna反应液c、ng rna内标溶液、ng rna消化反应液和质控品。

7.根据权利要求6所述的检测淋病奈瑟菌rna核酸序列的试剂盒，其特征在于，所述ngrna反应液b包括rpa mix。

8.根据权利要求6所述的检测淋病奈瑟菌rna核酸序列的试剂盒，其特征在于，所述质控品包括阴性质控品和阳性质控品，所述阴性质控品包括生理盐水，所述阳性质控品包括ng培养物。

9.根据权利要求6所述的检测淋病奈瑟菌rna核酸序列的试剂盒，其特征在于，所述ngrna反应液c包括激活剂，所述ng rna消化反应液包括dna酶i，所述ng rna内标溶液包括含内标片段的假病毒。

10.一种使用如权利要求4至9任意一项所述的试剂盒检测淋病奈瑟菌rna核酸序列的方法，其特征在于，包括：

技术总结
本申请实施例属于生物技术领域，涉及一种检测淋病奈瑟菌RNA核酸序列的恒温扩增引物对、探针、试剂盒及方法，所述恒温扩增引物对包括目的引物对和内标引物对，所述探针包括目的探针和内标探针，所述目的引物对包括NG RNA上游引物SEQ ID NO：1和NG RNA下游引物SEQ ID NO：2，所述目的探针为NG RNA探针SEQ ID NO：3，所述内标引物对包括外源性内标上游引物SEQ ID NO：4和外源性内标下游引物SEQ ID NO：5，所述内标探针为外源性内标探针SEQ ID NO：6。本申请能够快速准确检测NG RNA。

技术研发人员：刘悦,蒋析文,陈悦宁,许仁朝,孔绮君,董子维
受保护的技术使用者：广州达安基因股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15