一种牦牛MOGAT2基因CNV标记的检测方法及其应用

一种牦牛mogat2基因cnv标记的检测方法及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种牦牛mogat2基因cnv标记的检测方法及其应用。


背景技术：

2.近年来，牦牛产品逐渐走向大众视野，牦牛肉、牦牛奶等产品深受广大消费者的喜爱，此外在高原牧区，牦牛也是重要的畜种之一，其粪便可被用作燃料，毛皮等用来制作御寒衣物。因此牦牛品种资源的利用发展、育种工作的开展具有重要意义。目前，基因组选择、分子标记辅助选择、全基因组关联分析、基因芯片等技术发展迅速，在动物育种领域应用广泛。分子标记辅助选择(marker-assisted selection，mas)是将分子标记运用于育种的技术手段之一，其基本原理是利用与目标性状紧密链锁的遗传标记，对目标性状进行选择，该技术的应用能够有效改善传统育种方法速度慢、效率低的缺点。
3.拷贝数变异(copy number variations，cnvs)，作为一种新发现的基因组亚显微水平结构变异类型，是指基因组dna中较大片段的缺失或重复现象，涉及的片段大小在50bp到数mb之间，包括拷贝数增加(copy number gain)和拷贝数减少(copy number loss)。
4.cnv常用的检测方法主要分为在全基因组范围内检测未知cnv和用于定点检测或验证已知cnv两类。基因组未知cnv常用的检测方法有芯片法和测序法，但是，这两种方法受检测平台的局限，而且价格昂贵；对于已确定的cnv的检测，通常是采用基于pcr技术和杂交技术的一些方法。其中，实时荧光定量pcr(qpcr)最为常用。qpcr通过对目的基因(具有拷贝数变异)及参考基因(无拷贝数变异)进行相对定量，根据2-δδct
方法统计检测样本候选基因的拷贝数。该方法操作简单，普适度高，速度快，受认同程度高。
5.mogat2(monacylglycerol o-acyltransferase 2)是一个蛋白质编码基因。本发明意外发现，所述mogat2基因位于cnv区域，因此提供了一种与牦牛体重性状相关的cnv标记，并提供了一种方便、准确、大样本量的检测牦牛mogat2-cnv的检测方法，为牦牛的生长性状的早期选育提供了基础。


技术实现要素：

6.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种牦牛mogat2基因cnv标记的方法及其应用，尤其涉及一种基于qpcr技术检测牦牛mogat2基因cnv标记的方法及其应用。具体包括以下内容：
7.第一方面，本发明提供了一种与牦牛体重性状相关的cnv标记，所述cnv标记为牦牛mogat2基因候选区域chr 15：1483856-1497138的拷贝数变异。
8.优选地，根据2-δδct
法定量结果将所述拷贝数变异分为三类：2-δδct
＞2为插入型；2-δδct
《2为缺失型；2-δδct
＝2为正常型；所述正常型和缺失型的牦牛体重性状优于插入型。
9.第二方面，本发明提供了检测上述第一方面所述牦牛体重性状相关的cnv标记的试剂在检测牦牛体重性状中的应用；所述试剂上述第一方面所述cnv标记和内参基因btf。
10.优选地，所述扩增结果根据2-δδct
法定义拷贝数变异类型：2-δδct
＞2为插入型；2-δδct
《2为缺失型；2-δδct
＝2为正常型；所述正常型和缺失型的牦牛体重优于插入型。
11.优选地，所述试剂包括上述第一方面所述cnv标记的扩增引物对p1：
12.上游引物f1：5
’‑
cgctggtcaagactgcctat-3’；
13.下游引物r1：5
’‑
acagtgaggaaaacccggtg-3’；
14.和内参基因btf的扩增引物对p2：
15.上游引物f2：5
’‑
aaccaggagaaactcgccaa-3’；
16.下游引物r2：5
’‑
ttcggtgaaatgccctctcg-3’。
17.第三方面，本发明提供了一种检测上述第一方面所述牦牛体重性状相关的cnv标记的试剂在牦牛分子标记辅助选择育种中的应用；所述试剂上述第一方面所述cnv标记和内参基因btf。
18.优选地，所述扩增结果根据2-δδct
法定义拷贝数变异类型：2-δδct
＞2为插入型；2-δδct
《2为缺失型；2-δδct
＝2为正常型；所述正常型和缺失型的牦牛体重优于插入型。
19.优选地，所述试剂包括上述第一方面所述cnv标记的扩增引物对p1：
20.上游引物f1：5
’‑
cgctggtcaagactgcctat-3’；
21.下游引物r1：5
’‑
acagtgaggaaaacccggtg-3’；
22.和内参基因btf的扩增引物对p2：
23.上游引物f2：5
’‑
aaccaggagaaactcgccaa-3’；
24.下游引物r2：5
’‑
ttcggtgaaatgccctctcg-3’。
25.第四方面，本发明提供了一种用于检测与牦牛体重性状相关的cnv标记的引物对，所述引物对包括权利要求1所述cnv标记的扩增引物对p1：
26.上游引物f1：5
’‑
cgctggtcaagactgcctat-3’；
27.下游引物r1：5
’‑
acagtgaggaaaacccggtg-3’；
28.和内参基因btf的扩增引物对p2：
29.上游引物f2：5
’‑
aaccaggagaaactcgccaa-3’；
30.下游引物r2：5
’‑
ttcggtgaaatgccctctcg-3’。
31.第五方面，本发明提供了一种用于qpcr检测上述第一方面所述cnv标记的试剂盒，所述试剂盒含有上述第四方面所述的引物对。
32.优选地，所述试剂盒还包括2
×
sybr green qpcrmix、去离子水、对照样本中的一种或几种。
33.第七方面，本发明提供了一种与牦牛生长性状相关的cnv标记的检测方法，所述方法包括以下步骤：
34.以牦牛的基因组dna为模板，通过qpcr分别扩增权利要求1所述cnv标记和参照基因btf；
35.根据2-δδct
法定量结果将所述拷贝数变异分为三类：2-δδct
＞2时，为插入型；2-δδct
《2时，为缺失型；2-δδct
＝2为正常型；所述正常型和缺失型的牦牛体重性状优于插入型。
36.优选地，所述cnv标记的扩增引物对为：上游引物f1：5
’‑
cgctggtcaagactgcctat-3’；下游引物r1：5
’‑
acagtgaggaaaacccggtg-3’；所述内参基因btf的扩增引物对为：上游引物f2：5
’‑
aaccaggagaaactcgccaa-3’；下游引物r2：5
’‑
ttcggtgaaatgccctctcg-3’。
37.优选地，所述qpcr扩增体系包括：50ng/μl模板dna1μl，0.4pm的引物对p1或引物对p2所对应的上、下游引物各0.4μl，sybr premix ex taq ii 10μl以及ddh2o 8.2μl。
38.优选地，所述qpcr所用的反应程序为：
39.(1)预变性：90℃，30s；
40.(2)扩增反应：95℃，5s，之后60℃，30s，45个循环；
41.(3)绘制熔解曲线：95℃，5s，之后65℃，60s。
42.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：
43.本发明提供了一种与牦牛体重性状相关的cnv标记，所述cnv标记为牦牛mogat2基因候选区域chr 15：1483856-1497138的拷贝数变异；
44.本发明提供了检测cnv标记的方法，以牦牛的血液全基因组dna为模板，通过实时荧光定量pcr方法分别扩增牦牛mogat2基因cnv区域并将btf基因作为参照，根据2-δδct
法可以将牦牛结果分为插入型、缺失型和正常型，鉴定牦牛mogat2基因的拷贝数变异；所述拷贝数变异与牦牛体重性状相关，其中正常型和缺失型牦牛具有更高的体重；本发明在dna水平上检测与牦牛体重性状密切相关的cnv标记，可作为牦牛生长性状的标记辅助选择的重要候选分子标记；
45.本发明以牦牛mogat2基因的cnv为候选位点，通过实时荧光定量pcr技术检测该位点在牦牛群体中的拷贝数变异情况，并与6月龄、30月龄体重和体尺体高等重要生产性状进行关联分析；如果检测mogat2基因候选位点的拷贝数变异类型为正常型和缺失型，则正常型和缺失型个体具有更好生长性能；研究该基因cnv并将其与牦牛重要生长性状关联分析至关重要，可以为我国牦牛分子育种提供理论依据，便于牦牛生长性状的标记辅助选择，快速建立遗传资源优良的牦牛种群。
46.本发明提供的牦牛基因的拷贝数变异检测方法，可用于牦牛的早期选育；检测mogat2基因拷贝数变异的方法准确可靠、操作简便；mogat2基因拷贝数变异位点的检出，为牦牛的分子标记辅助选择提供科学依据。
附图说明
47.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
48.图1本发明实施例提供的检测阿什旦牦牛mogat2基因cnv标记的方法流程图；
49.图2本发明实施例提供的检测阿什旦牦牛mogat2基因cnv标记的qpcr试验的扩增曲线示意图；
50.图3本发明实施例提供的检测阿什旦牦牛mogat2基因cnv标记的qpcr试验的溶解峰示意图。
具体实施方式
51.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于
限定本发明。
52.本发明利用qpcr对阿什旦牦牛mogat2基因的拷贝数变异进行检测，具体流程如图1所示。
53.本发明所涉及的一种基于qpcr技术检测的cnv标记(位于阿什旦牦牛mogat2基因候选区域chr 15：1483856-1497138)。根据2-δδct
法将结果分为三类：2-δδct
＞2为插入型；2-δδct
《2为缺失型；2-δδct
＝2为正常型。
54.实施例1检测阿什旦牦牛hsf1基因cnv标记
55.1.检测方法
56.(1)阿什旦牦牛样本采集
57.本发明以阿什旦牦牛品种作为检测对象，从青海省大通种牛场采集了283头生长数据资料完善的阿什旦牦牛的血液样本。
58.(2)基因组dna的分离、提取、纯化
59.使用easy pure blood genomic dna kit试剂盒从阿什旦牦牛血液样本中提取基因组dna。采用1.2％琼脂糖凝胶电泳和thermo scientific nano drop 2000c检测dna的质量和浓度。
60.(3)目标基因及参考基因扩增
61.以ncbi数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的牦牛mogat2基因(目的基因)序列为参考序列，利用primer-blast工具设计qpcr引物对(引物对p1)检测mogat2基因拷贝数变异，同时，以btf为参考基因，采用相同的方法设计扩增参考基因(btf基因)。引物对序列信息如表1所示。
62.表1实时荧光定量pcr的引物信息
[0063][0064]
注：f表示上游引物，r表示下游引物。
[0065]
通过绘制扩增曲线和溶解峰来确定引物是否适用于qpcr分析。扩增曲线平滑，表明qpcr试剂质量好且扩增体系和条件合适(见图2)；绘制的熔解曲线，各样品曲线吻合在一起，且曲线走势平滑，峰高且尖，无引物二聚体或非特异扩增引起的杂峰，表明引物质量好(见图3)。
[0066]
其中，进行qpcr所用的扩增体系以20μl计为：50ng/μl模板dna1μl，0.4pm的上、下游引物各0.4μl、sybr premix ex taq ii 10μl，ddh2o 8.2μl。
[0067]
pcr扩增的反应程序为
[0068]
预变性：95℃，30s；
[0069]
扩增反应：95℃，5s，之后60℃30s，45个循环；
[0070]
绘制熔解曲线：95℃，5s，之后65℃，60s。
[0071]
(4)拷贝数变异的推断
[0072]
每个样品分别用目标序列和参考序列的引物(引物对p1和p2)进行扩增，并且每对引物3个重复。根据2-δδct
方法进行拷贝数的分析。其中δδct＝(ct
目的基因-ct
参考基因
)
实验组-(ct
目的基因-ct
参考基因
)
对照组
。实验组即为待检测有无cnvs的样本，对照组即为已知无拷贝数变异的样本。2-δδct
表示的是实验组目标序列的拷贝数相对于对照组的倍数，进行方差齐性检验后，统计检验个组间的差异。
[0073]
当目标序列为正常型序列时，根据2-δδct
计算出归一化值为2左右(2-δδct
＝2)；当目标序列为缺失型序列时，2-δδct
计算出归一化值小于2(2-δδct
＜2)；当目标序列为插入型序列时，2-δδct
计算出归一化值大于2(2-δδct
＞2)。
[0074]
(5)阿什旦牦牛mogat2基因cnv位点与牦牛生长性状的关联分析
[0075]
生长性状数据：6月龄体重、鬐甲高、体长、胸围；30月龄体重、鬐甲高、体长、胸围。
[0076]
关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用spss 19软件分析各基因型间的生产性状效应。
[0077]
在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：y
ijk
＝μ+cnvj+e
ijk
；其中，y
ijk
为性状观察值，μ为总体均值，cnvj为第j个拷贝数变异类型的固定效应，e
ijk
为随机误差，各组数据间的差异采用lsd多重比较进行检验，试验结果以均值
±
sd形式表示。
[0078]
关联分析结果如表2所示，表明在阿什旦牦牛中，mogat2基因cnv拷贝数插入显著不利影响牦牛生长性状，具体地，正常型和缺失性能够显著提高6月龄和30月龄牦牛的体重性状。总体来说，缺失型和正常型拷贝数变异对于牦牛的生长性状具有有利影响。表明mogat2的cnv拷贝数变异与阿什旦牦牛的生长发育相关。
[0079]
表2 mogat2基因cnv与阿什旦牦牛生长性状的关联分析
[0080][0081]
注：不同字母表示类型间差异显著(p《0.05或p《0.01)
[0082]
(6)上述cnv标记在阿什旦牦牛选育中的应用
[0083]
获得的cnv可作为候选分子遗传标记，寻找与其相关或紧密连锁的影响牦牛生长性状的数量性状基因座，以对阿什旦牦牛进行分子标记辅助选择，从而加快阿什旦牦牛品种改良的选育进程。
[0084]
综上所述，本发明对阿什旦牦牛的mogat2基因的拷贝数进行检测，并对该基因的
拷贝数与阿什旦牦牛生长性状进行关联分析，通过spss 19.0等软件的统计分析，发现阿什旦牦牛的mogat2基因的拷贝数显著影响阿什旦牦牛体重性状，即阿什旦牦牛的mogat2基因的拷贝数与阿什旦牦牛体重性状显著相关，具有缺失型和正常型的个体生长性状最优。该拷贝数变异的检出为阿什旦牦牛生长性状的分子辅助选育提供了科学依据。本发明提供的cnv标记为提高阿什旦牦牛选育提供了理论基础，可用于阿什旦牦牛的早期选育，可加快阿什旦牦牛的种质资源改良。
[0085]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。