一种基于CRISPR/Cas12a的解旋酶依赖等温扩增检测技术及应用

本发明属生物检测，具体涉及一种基于crispr/cas12a的解旋酶依赖等温扩增检测技术及应用。

背景技术：

1、近年来，科研人员为了更快速、更准确的得到病毒检测结果，对检测技术进行了深入的研发和探索。目前的主流检测技术仍是pcr，无论是新冠病毒或是猴痘病毒；以猴痘病毒为例，该病毒属于痘病毒科正痘病毒属，是典型的双链dna病毒，现行的猴痘防控技术指南推荐实时荧光定量pcr检测为猴痘病毒检测的参考方法，实时荧光定量pcr技术是最经典的分子检测技术，应用于各类型病毒和细菌的检测。该技术的不足与缺陷是受限于特殊仪器的制约，限制了它的大规模应用，不利于一些偏远地区的大规模筛查开展。为了解决这一问题，科研人员把目光投向了等温扩增这一技术，等温扩增技术是近年来发展起来的基于恒温扩增的新技术，主要有以下几种技术：环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification，lamp)、交叉引物扩增(crossing priming amplification，cpa)、链置换扩增(strand displacement amplification，sda)、重组酶聚合扩增(recombinasepolymerase amplification，rpa)、依赖核酸序列的扩增(nucleic acid sequence-basedamplification，nasba)、滚环扩增(rolling circle amplification，rca)、解旋酶介导扩增(helicase-dependent amplification，hda)等。这些扩增技术各有优劣，其中解旋酶介导等温扩增技术自2004年正式问世以来，技术不断更新，目前已进化至第三代；灵敏度和特异性不断提高，操作技术不断简便。该技术的核心原理是术模仿自然界dna合成方式，利用dna解旋酶解开双链并完成扩增，而非通过变性-退火-延伸过程的多次循环实现，因此可以在同一温度下进行，不需要昂贵的pcr仪，有利于在基层实验室推广使用；扩增反应过程简单，时间明显缩短。由于hda和pcr技术的相似性，所以它可以替代pcr技术举行基因检测，它具有灵敏度佳、反应迅速、无需变温仪器等优点，但该技术易产生引物二聚体，有时会导致假阳性的产生，另外其灵敏度海有待提高。近年来研究表明，crispr系统是一种高效的分子检测工具，具有灵敏度高、特异性好的优点。已经报道的系统有：crispr/cas9、crispr/cas12a、crispr/cas13a等。doudna团队是首次利用crispr/cas12a的反式切割活性，实现了核酸的检测；现有技术报道已成功利用crispr/cas13a的反式切割活性检测寨卡病毒与登革热病毒。

技术实现思路

1、本发明第一方面的目的，在于提供一种检测猴痘病毒b6r基因的试剂。

2、本发明第二方面的目的，在于提供一种试剂盒。

3、本发明第三方面的目的，在于提供本发明第一方面的试剂和/或本发明第二方面的试剂盒的应用。

4、本发明第四方面的目的，在于提供一种非疾病诊断目的的基于hda-crispr/cas12a的猴痘病毒b6r基因的检测方法。

5、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

6、本发明的第一个方面，提供一种检测猴痘病毒b6r基因的试剂，所述试剂包括检测b6r基因的crrna和/或扩增b6r基因的引物对；所述crrna包括锚定序列和向导序列，所述锚定序列能够与cas蛋白结合，所述向导序列与所述引物对的扩增产物序列相匹配。

7、优选地，所述引物对包括如seq id no:2所示的上游引物和如seq id no:3所示的下游引物。

8、优选地，所述crrna序列如seq id no:4所示。

9、优选地，所述锚定序列为uaauuucuacuaaguguagau(seq id no:10)。

10、优选地，所述向导序列为uaaucuccauuauaguauua(seq id no:11)。

11、优选地，所述cas蛋白为cas12a。

12、优选地，所述引物对可用于hda技术和/或普通pcr技术。

13、本发明第二方面，提供一种包含第一方面的试剂的试剂盒。

14、优选地，所述试剂盒还包括cas蛋白。

15、优选地，所述cas蛋白选自cas12i、cas12j、cas12a、cas12b、cas12d、cas12e、cas12f、cas12g、cas12h中的一种或任意几种组合；进一步为cas12a。

16、优选地，所述试剂盒还包括hda缓冲液、atp、聚合酶、解旋酶、dntp的至少一种。

17、优选地，所述聚合酶包括bst dna聚合酶和/或taq dna聚合酶；进一步为bst dna聚合酶。

18、优选地，所述解旋酶包括tteuvrd解旋酶和/或大肠杆菌解旋酶；进一步为tteuvrd解旋酶。

19、当解旋酶为大肠杆菌解旋酶，其耐热效果不佳，需与单链结合蛋白搭配使用，增加实验成本。

20、优选地，所述试剂盒还包括信号报告探针。

21、优选地，所述信号报告探包含核酸序列，所述核酸序列的5'端修饰荧光基团，3'端修饰淬灭基团。

22、优选地，所述信号报告探的核酸序列为5’-ttatt-3’。

23、优选地，所述荧光基团为fam、hex、htx、vic、tamra、rox和cy5中的至少一种；进一步为6-fam(6-羧基荧光素)。

24、优选地，所述淬灭基团为bhq1、bhq2和bhq3中的至少一种；进一步为bhq1。

25、通过引入信号报告探针，利用cas12a的附带切割效应，可以放大体系中的检测信号，提高检测的灵敏度。

26、本发明第三方面，提供本发明第一方面的试剂和/或本发明第二方面的试剂盒在1)～6)中任一种中的应用；

27、1)猴痘病毒的b6r基因的检测；

28、2)制备检测猴痘病毒的b6r基因的检测的产品；

29、3)检测待测样本是否含有猴痘病毒的b6r基因；

30、4)制备检测待测样本是否含有猴痘病毒的b6r基因的产品；

31、5)筛选预防或治疗猴痘病毒的药物；

32、6)制备筛选预防或治疗猴痘病毒的药物的产品；

33、上述应用用于非疾病的诊断与治疗。

34、本发明第四方面，提供一种非疾病诊断目的的基于hda-crispr/cas12a的猴痘病毒b6r基因的检测方法，包括采用本发明第一方面的试剂和/或本发明第二方面的试剂盒的步骤。

35、优选地，所述检测方法具体包括以下步骤：

36、(1)获取待测样本的核酸；

37、(2)将步骤(1)中的核酸与本发明第一方面中的引物对、第二方面的hda缓冲液、atp、聚合酶、解旋酶和dntp混合，进行hda等温扩增，得到hda扩增产物；

38、(3)将步骤(1)所述的hda扩增产物与本发明第一方面中的crrna、本发明第二方面中的cas蛋白和信号报告探针混合，进行crispr反应检测，读取荧光信号；

39、(4)根据荧光信号判定待测样本是否含有猴痘病毒的b6r基因。

40、通过加入基于hda反应的核酸扩增步骤，不仅使该检测技术的应用范围扩大到病毒和dna都可以检测，同时明显提高了检测的灵敏度。

41、优选地，步骤(2)中所述hda等温扩增的条件为60～70℃反应0.5～1.5h；进一步为65～70℃反应1～1.5h。

42、优选地，步骤(3)中检测的条件为37～40℃反应30～60mim；进一步为37～38℃反应30～50mim。

43、该检测方法原理如下：解旋酶打开dna双链，形成dna单链，引物与单链的dna互补区域结合；dna聚合酶扩增延伸形成新双链；新双链再进行下一轮扩增，循环往复。扩增的产物为双链dna，crrna识别并结合dna双链，从而激活cas蛋白的侧枝切割活性，切割单链dna荧光报告探针，释放荧光信号(图1)。该检测方法用解旋酶功能替代热变形功能，生物能替代化学能，减少反应中热循环步骤；降低能耗，减除了实际应用中的诸多限制。cas检测系统的引入完全弥补了hda技术的特异性不足和引物二聚体过多的问题，提高了检测方法的实用价值。

44、本发明的有益效果是：

45、本发明提供的检测猴痘病毒b6r基因的试剂，该试剂中的引物对可用于hda等温扩增技术以检测快速、准确的检测碳猴痘病毒b6r基因，其灵敏度高，特异性较强。针对猴痘病毒b6r基因特异性的设计的crrna可与猴痘病毒b6r基因保守序列特异性形成互补双链，与其他病毒(如痘苗病毒、牛痘病毒、鼠痘病毒、骆驼痘病毒、天花病毒)不存在交叉反应，提高了猴痘病毒b6r基因检测的特异性。

46、本发明所提供的一种基于hda-crispr/cas12a的猴痘病毒b6r基因的检测方法，将hda扩增与crispr/cas12a结合，实现了快速、简便的一管检测，可以避免多次开盖带来的污染问题。利用hda技术实现dna模板的扩增放大，简便、快速，利用cas12a系统实现信号检测，灵敏度高(检测限为19am)、特异性好。该检测方法不仅克服了pcr或dna测序等分子检测技术存在的操作繁琐、仪器昂贵、对实验场地和人员要求比较高、难以适用于现场大规模筛查的缺点，其两个扩增检测环节均在恒温下进行，因此整个检测过程只需一台便携恒温荧光信号检测仪即可完成，非常适用于基层单位和环境条件有限的场地使用。