一种测定抗组蛋白抗体IgG的试剂盒及检测方法与流程

本发明属于磁微粒化学发光免疫诊断
技术领域：
：，具体涉及一种测定抗组蛋白抗体igg的试剂盒及检测方法。
背景技术：
：：抗核抗体(antinuclearantibody，ana)又称抗核酸抗原抗体，是一组将自身真核细胞的各种成分脱氧核糖核蛋白(deoxyribonucleoprotein，dnp)、dna、可提取的核抗原(extractablenuclearantigen，ena)和rna等作为靶抗原的自身抗体的总称。抗核抗体在多种自身免疫病中均呈不同程度的阳性率，如系统性红斑狼疮(sle，95％～100％)、类风湿性关节炎(ra，10％～20％)、混合性结缔组织病(mctd，80％～100％)、干燥综合症(ss,10％～40％)、全身性硬皮病(pss，85％～90％)、狼疮性肝炎(lh，95％～100％)、原发性胆汁性肝硬化(pbc，95％～100％)等。其中，组蛋白(histone,his)是ana的主要靶抗原之一。组蛋白是一种与dna结合组成染色体的碱性蛋白质，由h1、h2a、h2b、h3、h4、h5、[h2a-h2b]-dna二聚体组成，常以四聚体形式存在组成核小体，无种属特异性和器官特异性，易与dna、抗体及补体成分结合，正常人群常为阴性。抗组蛋白抗体多见于50％～70％sle，也见于95％的药物性狼疮患者，后者常缺乏针对h2a、h2b的自身抗体。也有学者报告sle患者抗组蛋白抗体阳性率为35.6％，但活动性sle患者高达90％，其中94％的患者无明确服药史；原发性胆汁性肝硬化患者为5％～14％，类风湿性关节炎为24％，特别是伴有血管炎的患者；抗h2a-h2b复合物的组蛋白抗体，在sle和普鲁卡因酰胺诱发的sle阳性率较高，而抗h3-h4复合物的组蛋白抗体则多见于肼屈嗪诱发的sle患者。由于间接免疫荧光法检测抗组蛋白抗体费时费力，目前常用elisa法。组蛋白亚型较多，在做组蛋白总抗体检测时，最好同时检测抗h2a、h2b抗体，以排除药物性狼疮。目前对于抗his抗体的检测方法已有报道，对于此病的检测方法主要为间接免疫荧光法和酶联免疫吸附法，但这些方法都存在着不足之处；一、间接免疫荧光法该法的基本原理是血清样本中的特异性抗体与切片中的抗原特异性结合后，继用间接荧光抗体，与抗原抗体复合物结合，形成抗原抗体荧光复合物。在荧光显微镜下，根据复合物的发光情况来确定所检测的结果。该方法评价：由于结合在抗原抗体复合物上的荧光素抗体增多，发出的荧光亮度强，因而其敏感性强。但是其不足也是明显的：(1)运用此法是可能出现假阳性。(2)在分析结果时无法根据分子量的大小区分非特异性反应。(3)操作相对复杂，需要价格较昂贵的荧光显微镜，在很多基层医院难以推广，同时，不适用于样本量较大的实验室和诊断医院。(4)荧光测定中的本底较高，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。(5)结果判定需要有经验的专业人员，分析结果的客观性不足。二、酶联免疫吸附法elisa检测抗his抗体，简便易行，特异性高，与间接免疫荧光法联合检测，可为临床对抗核抗体的诊断和治疗提供更为客观的实验依据。但与其他生物检测或免疫检测比较，这种elisa检测方法、技术、工具或产品仍有较多的不足而使其应用受限，这些不足主要包括以下几个方面：(1)检测试剂在检测过程中为开放方式，不但容易受外界环境的影响，而且容易引起各种试剂之间的交叉污染而影响检测结果；(2)elisa检测范围和灵敏度都比较低。(3)elisa方法的检测时间较长，完成一个测试一般需要2个小时以上，不能完全满足临床上的快速诊断的需求。(4)elisa方法不能随机进样检测，检测结果存在滞后性。cn105954267a公开了一种抗组蛋白抗体igg的磁微粒化学发光定量测定试剂盒及制备和检测方法，该试剂盒包括：抗组蛋白抗体igg校准品；抗组蛋白抗体igg质控品；含生物素标记的组蛋白抗原和牛血清白蛋白的tris缓冲液；含碱性磷酸酶标记的羊抗人多克隆抗体和牛血清白蛋白的tris缓冲液；含链霉亲和素标记的磁微粒和牛血清白蛋白的tris缓冲液；清洗液。该专利中仅采用含生物素标记的组蛋白抗原，从而使得sle患者的阳性检出率较低。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供一种sle患者的阳性检出率高的测定抗组蛋白抗体igg的试剂盒及检测方法。为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：本发明的一个目的是提供一种测定抗组蛋白抗体igg的试剂盒，所述的试剂盒包括第一试剂和第二试剂，所述的第一试剂包括偶联有生物素的混合抗原，所述的混合抗原包括组蛋白抗原、h1片段以及h2a-h2b复合片段；所述的第二试剂包括偶联有碱性磷酸酶的抗人igg抗体。优选地，所述的组蛋白抗原、所述的h1片段、所述的h2a-h2b复合片段的质量比为2～3：1～2：1。优选地，所述的第一试剂中所述的偶联有生物素的混合抗原的浓度为1～5微克/毫升。优选地，所述的第二试剂中所述的偶联有碱性磷酸酶的抗人igg抗体的浓度为0.1～2.5微克/毫升。优选地，所述的试剂盒还包括磁微粒分离试剂、化学发光底物、校准品、质控品和清洗液，其中，所述的磁微粒分离试剂包括表面连接有亲和素的纳米磁微粒。进一步优选地，所述的校准品包括所述的抗组蛋白抗体的浓度为20ru/ml的第一校准品和所述的抗组蛋白抗体的浓度为200ru/ml的第二校准品。进一步优选地，所述的质控品包括所述的抗组蛋白抗体的浓度为10ru/ml的第一质控品和所述的抗组蛋白抗体的浓度为80ru/ml的第二质控品。本发明中采用的化学发光底物为申请号为cn201510359183.0公开的一种碱性磷酸酶的酶促化学发光底物。本发明的化学发光底物具有强度高、灵敏度高、持续时间长、稳定性好等优点。由于amppd可以起到共表面活性剂的作用，能使该化学发光底物更好的结合到化学发光缓冲体系中，从而大幅度提高化学发光效率，在碱性磷酸酶的催化下释放光子。本发明的另一个目的是提供一种所述的试剂盒的制备方法，所述的第一试剂的制备方法包括如下步骤：(1)将混合抗原与经n-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素按质量比10～50:1的比例混合，然后在15～40℃下静置20～40min；(2)加入物质的量浓度为0.01～0.11mol/l的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，在15～40℃下静置10～20min，再加入甘油，得到浓溶液；其中，所述的三羟甲基氨基甲烷缓冲液的添加量为每1毫克所述的混合抗原加入15～20微升；所述的甘油的添加量为每1毫克所述的混合抗原加入400～600微升；(3)用ph为7～7.5、物质的量浓度为0.005～0.1mol/l的磷酸盐缓冲液将所述的浓溶液稀释成偶联有生物素的混合抗原的浓度为1～5微克/毫升，即得所述的第一试剂；所述的第二试剂的制备方法包括如下步骤：(1)将抗人igg抗体加入到浓度为4～20mg/ml的2-亚胺基硫烷盐酸盐偶联剂中，在15～40℃下静置18～25min；其中，所述的2-亚胺基硫烷盐酸盐偶联剂的添加量为每1毫克所述的抗人igg抗体添加10～15毫升；(2)向步骤(1)中加入浓度为0.05～0.11mol/l甘氨酸溶液，在15～40℃下静置4～5min，用g-25凝胶柱除盐，收集活化后的抗人igg抗体，其中，所述的甘氨酸溶液的添加量为每1毫克所述的抗人igg抗体添加0.5～0.6毫升；(3)将碱性磷酸酶加入到浓度为4～5mg/ml的4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液中，在15～40℃下静置25～35min，用g-25凝胶柱除盐，收集活化后的碱性磷酸酶，其中，所述的4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液的添加量为每1毫克所述的碱性磷酸酶添加0.25～0.9毫升；(4)将步骤(2)活化后的抗人igg抗体和步骤(3)活化后的碱性磷酸酶混合，在2～8℃下静置12～24h，用supperdex200凝胶纯化柱纯化，获得连接物浓溶液，其中，所述的抗人igg抗体和所述的碱性磷酸酶的投料质量比为1:0.5～1.5；(5)将所述的连接物浓溶液用含质量百分比为0.1～3％的牛血清白蛋白、ph为7.8～8.0、物质的量浓度为0.01～0.11mol/l的三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释到偶联有碱性磷酸酶的抗人igg抗体的浓度为0.1～2.5微克/毫升，即得所述的第二试剂。优选地，所述的校准品的制备方法为：将抗组蛋白抗体用ph为7～7.5、物质的量浓度为0.005～0.1mol/l的磷酸盐缓冲液稀释成浓度分别为20ru/ml的第一校准品与200ru/ml的第二校准品。优选地，所述的质控品的制备方法为：将抗组蛋白抗体用ph为7～7.5、物质的量浓度为0.005～0.1mol/l的磷酸盐缓冲液稀释成浓度分别为10ru/ml的第一质控品与80ru/ml的第二质控品。本发明的第三个目的是提供一种所述的试剂盒的检测方法，包括如下步骤：(1)在检测管中依次加入磁微粒分离试剂与第一试剂，然后加入待测样本，混匀，在36～38℃下温育10～25min，再用清洗液在磁场作用下清洗，其中所述磁微粒分离试剂、所述第一试剂和所述待测样本的投料体积比为1:0.5～2：0.2～0.5；(2)去除磁场，然后加入第二试剂，混匀，在36～38℃下温育10～25min，再用清洗液在磁场作用下清洗，其中所述待测样本与所述第二试剂的投料体积比为1:4～8；(3)去除磁场，然后加入化学发光底物，充分混悬后在36～38℃下温育5～10min，检测相对发光强度值。由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：本发明的试剂盒及检测方法具有稳定性好，灵敏度高，重复性好等优点，同时检测时间短，完成一个测试所需的总时间在50分钟以内，而且操作简单方便，真正实现了检测全自动化，另外，本发明的试剂盒sle患者的阳性检出率高。附图说明附图1为检测原理图；附图2为线性回归曲线。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件，本发明中的试剂均可市购获得。实施例1：第一试剂的制备1、材料与仪器：材料：组蛋白抗原，h1片段，h2a-h2b复合片段，n-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素，三羟甲基氨基甲烷缓冲液，甘油，磷酸盐缓冲液；仪器：冰箱。2、制备步骤：步骤1：将0.5mg混合抗原(组蛋白抗原、h1片段、h2a-h2b复合片段的质量比为2：1：1)与0.01mgn-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素混合，在25℃下静置30min；步骤2：加入10ul的物质的量浓度为0.01mol/l的三羟甲基氨基甲烷缓冲液，在25℃下静置15min，再加入300ul的甘油，获得生物素化的his抗原，在-20℃保存备用；步骤3：用ph为7-7.5、物质的量浓度为0.01mol/l的磷酸盐缓冲液将生物素化his抗原稀释成浓度为1ug/ml的溶液，即得第一试剂。实施例2：第二试剂的制备1、材料与仪器：材料：抗人igg抗体，2-亚胺基硫烷盐酸盐偶联剂，甘氨酸，碱性磷酸酶，4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液，牛血清白蛋白，三羟甲基氨基甲烷缓冲液；仪器：冰箱、g-25凝胶柱、supperdex200凝胶纯化柱；2、制备步骤：步骤1：将5mg抗人igg抗体加入到50ml浓度为10mg/ml的2-亚胺基硫烷盐酸盐偶联剂中，在25℃下静置20min；步骤2：加入3ml的0.1mol/l甘氨酸溶液，在25℃下静置5min，用g-25凝胶柱除盐，收集活化后抗人igg抗体，2-8℃保存备用；步骤3：将5mg碱性磷酸酶加入到2.5ml5mg/ml的4-(n-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯溶液中，在25℃下静置30min，用g-25凝胶柱除盐，收集活化后碱性磷酸酶，2-8℃保存备用；步骤4：将活化后的抗人igg抗体和活化后的碱性磷酸酶混合，在5℃下静置20h，用supperdex200凝胶纯化柱纯化，获得连接物浓溶液，在2-8℃保存备用；步骤5：将所述连接物浓溶液用含质量百分比为1％的牛血清白蛋白、ph为7.9、物质的量浓度为0.1mol/l的三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释到含碱性磷酸酶标记的抗人igg抗体的浓度为1μg/ml，即得所述的第二试剂。实施例3：校准品的制备1、材料与仪器：材料：抗组蛋白抗体，磷酸盐缓冲液，标准品；2、制备步骤：选取抗组蛋白抗体，用ph为7-7.5、物质的量浓度为0.01mol/l的磷酸盐缓冲液按一定的比例稀释，参照标准品，配制成浓度分别为20ru/ml与200ru/ml的校准品。实施例4：质控品的制备1、材料与仪器：材料：抗组蛋白抗体，磷酸盐缓冲液，标准品；2、制备步骤：抗组蛋白抗体，用ph为7-7.5、物质的量浓度为0.01mol/l的磷酸盐缓冲液按一定的比例稀释，参照标准品，配制成浓度分别为10ru/ml与80ru/ml的质控品。实施例5：磁微粒分离试剂，清洗液。化学发光底物为申请号为cn201510359183.0公开的一种碱性磷酸酶的酶促化学发光底物中的表1.2apsh-1的配方二所示，即实施例6：全自动化学发光测定仪测试步骤全自动化学发光测定仪测试依次进行以下步骤：步骤1：检测试剂盒需与本公司全自动化学发光测定仪配套使用，将试剂盒放入全自动化学发光测定仪试剂仓相应位置，试剂盒信息通过条形码扫描仪输入仪器系统或通过仪器配套软件设定。步骤2：将校准品置于仪器样本仓。通过条形码扫描仪识别校准品信息，并在仪器系统中分配校准品位置。步骤3：将质控物/待测样本置于仪器样本仓，通过仪器配套软件编辑相应检测信息。步骤4：启动运行程序，所有校准品/质控物/待测样本处理步骤将自动执行。其中，以设备检测待测样本为例，设备自动执行时的步骤为：步骤1：在检测管中依次加入50μl磁微粒分离试剂与50μl第一试剂，然后加入20μl待测样本，混匀，在37℃下温育20min；步骤2：添加磁场，使步骤1温育后的体系在磁场中沉降，去除上清液，加入500μl清洗液进行3-5次清洗后；步骤3：去除磁场，然后向步骤2清洗后的体系中加入100μl第二试剂，混匀，在37℃下温育15min；步骤4：添加磁场，使步骤3温育后的体系在磁场中沉降，去除上清液，加入500μl清洗液进行3-5次清洗后，去除磁场，震荡使磁微粒充分混悬；步骤5：添加磁场重复步骤4进行再次清洗，使混悬后的磁微粒在磁场中沉降，去除上清液，去除磁场，然后加入150μl化学发光底物，去除磁场，充分混悬后在37℃下温育5min检测相对发光强度值。当检测试剂盒配合全自动化学发光测定仪配套使用时，从稀释、加样、孵育、清洗以及检测步骤均实现了全自动化，可以无人值守流水操作。全自动封闭操作系统，不仅操作简易方便、可靠性高、稳定性好、检测结果重复性好，避免了人为操作带来的结果偏差，同时有效的提高了检测效率及节省人力成本。本试剂盒的性能评估：1、本发明试剂盒(1)样本比对阴、阳性符合率：本发明试剂盒对临床血清检测抗his抗体的含量，并与国外知名公司同类产品elisa进行临床比对，结果表明，本发明抗his抗体检测试剂盒阴性符合率95.3％(242/254)、阳性符合率：88.0％(88/100)，具体数据见表1；单独组蛋白抗原阴性符合率：89.4％(227/254)，阳性符合率：70％(70/100)，具体数据见表2；单独h1抗原阴性符合率：87％(221/254)，阳性符合率：77％(77/100)，具体数据见表3；单独h2a-h2b复合片段抗原阴性符合率90.6％(230/254)，阳性符合率：82％(82/100)，具体数据见表4。和荧光法相比，本发明试剂盒阴性符合率为97.5％(195/200)，阳性符合率为90.0％(135/150)，具体数据见表5；单独组蛋白抗原阴性符合率：92.5％(185/200)，阳性符合率：83.3％(125/150)，具体数据见表6；单独h1抗原阴性符合率：95％(190/200)，阳性符合率：86.7％(130/150)，具体数据见表7；单独h2a-h2b复合片段抗原阴性符合率95％(190/200)，阳性符合率：90％(135/150)，具体数据见表8。可见本试剂盒和市场上现有抗his抗体检测试剂一致程度很高，比单独抗原的试剂临床比对符合率要提高不少。同时，我们检测了一下本发明试剂盒的临床符合率，选取了150例sle患者，50例类风湿患者患者，50例强直性脊柱炎，100例健康体检人，结果显示，sle样本阳性检出率为90％(135/150)，风湿患者样本阳性检出率为30％(15/50)，直性脊柱炎样本阳性检出率为0％(0/50)，健康体检样本阳性检出率为3％(3/100)，本发明的试剂盒对sle患者的灵敏度为90％，特异性为96.5％(193/200),具体数据见表9。表1表2表3表4表5表6表7表8表9(2)灵敏度：本发明试剂盒lod为0.084ru/ml，而酶联免疫法的灵敏度为2ru/ml。(3)线性：将一份高值血清按照1/2、1/4、1/8、1/16、1/40、1/80、1/200、1/400的比例稀释，用试剂盒检测稀释样本，以稀释比例和检测浓度做回归曲线。求出相关系数r的平方值。结果见图2，结果表明抗组蛋白抗体试剂盒的线性相关系数为0.9987，大于0.99，斜率为1.01。(4)准确度：在一份基础血清上按照9:1的比例分别添加高值血清、中值血清，各形成2个浓度水平的血清添加样本，检测样本浓度，按下述公式计算回收率。本方法的血清加样回收率在85％-115％之间，数据见表10。加样回收率＝添加后样本值/(0.9*样本a+0.1*样本b)*100％式中：样本a为基础血清，样本b为添加高值血清、中值血清。表10(5)精密度：对三种不同浓度的质控品进行检测，每天两次，分上下午检测，每次进行4个重复，共检测10天，每种浓度共测定80次，计算变异系数，结果表明变异系数在10％以内，结果见表11。表11浓度(ru/ml)测定次数分析间cv(％)10803.620804.5100803.1(6)稳定性：将本发明抗his抗体检测试剂盒37℃放置7天后，测定高、中、低3个浓度的质控，结果表明3种质控的检测浓度均在质控的浓度范围内。表明抗his抗体检测试剂盒稳定好，符合临床要求。(7)特异性：对高、中、低不同浓度值的样本添加不同浓度的胆红素、血红蛋白、类风湿因子、甘油三酯、人抗小鼠抗体检测结果见表12，结果显示，添加物质对本发明抗his抗体检测试剂盒检测结果没有影响。表12干扰物添加浓度交叉反应率(％)胆红素20mg/dl0.13血红蛋白1000mg/dl0.47甘油三酯2000mg/dl0.50人抗小鼠抗体2000ng/ml0.76类风湿因子1000iu/ml1.08以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。当前第1页12当前第1页12