一种用于监测急性髓系细胞白血病微小残留病灶的流式细胞术试剂盒及监测方法与流程

本发明涉及流式细胞术领域，具体讲，涉及一种用于监测急性髓系细胞白血病微小残留病灶的流式细胞术试剂盒及监测方法。

背景技术：

1、急性髓系白血病(aml)是血液和骨髓中髓系原始细胞的克隆扩增导致的异质性血液系统恶性肿瘤性疾病。白血病细胞的自我更新能力增强、增殖失控，可导致分化障碍及凋亡受阻，同时抑制骨髓正常造血并可浸润至肝、脾、淋巴结等各个脏器，表现出感染、出血、贫血等临床征象。aml是成人白血病中最常见的类型，且发病率随年龄的增长呈上升趋势。虽然其临床缓解率可达80％以上，但仅30％～40％的年轻患者和不及20％的老年患者能达到5年以上长期无病生存。复发仍是困扰白血病治愈的一个难点。而形态学方法评价疗效及预后存在不足，治疗后达到完全缓解的患者中很多人会在不同时间间隔后复发。此时微小残留病(mrd)检测的出现为解决这一临床问题提供了可能性。

2、微小残留病(mrd)是指急性白血病患者诱导化疗或骨髓移植后，达到临床和血液学的完全缓解(形态学骨髓中原始及幼稚细胞小于5％),体内残存少量白血病细胞的状态，mrd是白血病复发的首要原因。因此对于白血病患者来说，检测mrd的意义非常重要：1.有利于更早的预测白血病的复发；2.指导白血病的临床治疗，根据体内白血病细胞多少决定是否继续化疗或停止治疗，更好的制定有效治疗方案，避免过度治疗；3.有利于较早的发现白血病细胞是否耐药，选择临床更敏感，更具有杀伤力的治疗措施；4.有助于评价自体造血干细胞移植患者的干细胞净化效果。

3、近20年来，随着mrd检测技术日新月异，mrd的多种检测方法已被广泛用于临床评估疗效，如流式细胞术(flow cytometry，fcm)、pcr(polymerase chain reaction)、fish以及质谱技术等，mrd技术需要灵敏高，实用性强，准确，可靠，快速。骨髓细胞形态学、常规核型分析以及fish技术由于敏感性低，远远不能满足临床对mrd检测敏感性的要求，目前临床mrd主要的检测方法为fcm和聚合酶链反应。两者均具有高敏感性且相关性良好，二者一致性达89.7％，但是pcr-融合基因只能应用于部分aml患者中，因为并不是所有aml患者都有融合基因或存在突变等，而fcm主要通过检测白血病细胞的发育模式和特异性标志的表达是否正常进行判断，几乎可用于所有患者，检测深度可达到104-5。但是目前传统流式检测通道较少，补偿难调，常用的检测抗体只限于每管8～10个，而已有技术中应用于mrd的流式检测抗体大于20个，因此以往的检测只能选择一线抗体和与髓细胞发育模式紧密相关的必要抗体，很难将残留的白血病细胞全部检测到，而aml患者如果存在mrd，异常的表达和发育多数不同于初诊，需要更广泛的抗体来监测，因此，检测的抗体广度不足是部分患者mrd检测阴性后仍旧复发的主要原因。

4、2017年全光谱流式的问世，一跃将三激光流式的检测通道从传统流式的4-13个提高到38个，可实现一管25色以上监测，大大提高了检测信息量，提高了诊断精度和免疫学检测的深度。

5、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明第一发明目的在于提供一种用于监测急性髓系细胞白血病微小残留病灶的流式细胞术试剂盒。

2、本发明第二发明目的在于提供该试剂盒的使用方法。

3、本发明的第三发明目的在于提供一种急性髓系细胞白血病微小残留病灶的监测方法。

4、为了实现本发明的发明目的，采用的技术方案为：

5、本发明提出一种用于监测急性髓系细胞白血病微小残留病灶的流式细胞术试剂盒，所述试剂盒中含有分别标记有不同荧光素的抗体，所述抗体包括；用于检测粒系发育的相关抗体包括抗cd117抗体、抗cd34抗体、抗cd33抗体、抗cd13抗体、抗cd11b抗体、抗cd15抗体、抗cd64抗体、抗hla-dr抗体、抗cd45抗体、抗cd38抗体、抗cd14抗体和抗cd123抗体；和用于检测异常表达相关抗体包括抗cd19抗体、抗cd7抗体和抗cd56抗体。

6、可选的，所述抗cd33抗体连接有荧光素rb515、所述抗cd38抗体连接有荧光素apc-cy7、所述抗cd15抗体连接有荧光素fitc、所述抗cd34抗体连接有荧光素pe-cy5、所述抗cd14抗体连接有荧光素rv444、所述抗cd64抗体连接有荧光素rr664、所述抗cd117抗体连接有荧光素rb608、所述抗cd19抗体连接有荧光素rb780、所述抗cd7抗体连接有荧光素rv480、所述抗cd56抗体连接有荧光素pe、所述抗cd45抗体连接有荧光素rb697、所述抗cd11b抗体连接有荧光素rb730、所述抗hla-dr抗体连接有荧光素apc、所述抗cd123抗体连接有荧光素rv780、所述抗cd13抗体连接有荧光素rb710。

7、可选的，所述抗体的制剂为液体制剂或冻干粉；在所述液体制剂中，所述抗体的浓度为80～120μg/ml，优选100μg/ml。

8、可选的，所有所述抗体包装于一个容器内，优选的，在所述容器内所述抗体质量为80～120μg；更优选的，所述容器的体积为5ml。

9、本发明还涉及该试剂盒的使用方法，至少包括以下步骤：

10、(1)取1个空流式管和一个抗体组合管，标记为对照和样本管；

11、(2)在样本管和对照管中分别加入待测样本，混匀，避光孵育15～20min；

12、(3)在样本管和对照管中分别加入红细胞裂解液，混匀，裂解8～10min；

13、(5)离心，清洗；

14、(6)再匀混，上机检测。

15、可选的，所述孵育的时间为10～20分钟，优选15分钟。

16、可选的，所述裂解的时间为10～15分钟，优选10分钟。

17、可选的，所述使用方法中的操作均在室温条件下进行。

18、本发明还涉及一种监测急性b淋巴细胞白血病微小残留病灶的监测方法，至少包括以下步骤：

19、(1)取1个空流式管和一个抗体组合管，标记为对照和样本管；

20、(2)在样本管和对照管中分别加入待测样本，混匀，避光孵育15～20min；

21、(3)在样本管和对照管中分别加入红细胞裂解液，混匀，裂解8～10min；

22、(5)离心，清洗；

23、(6)再匀混，上机检测；

24、本发明至少具有以下有益的效果：

25、本发明试剂盒包括15个抗体，针对髓系细胞的发育模式和抗原表达强度进行检测，通过与正常模式对比即可检测到微量的白血病残留病灶，同时结合全光谱流式细胞仪，可一管panel完成以上所有检测，方便快捷，省时省力，操作简单。

技术特征：

1.一种用于监测急性髓系细胞白血病微小残留病灶的流式细胞术试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有分别标记有不同荧光素的抗体，所述抗体包括；

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗cd33抗体连接有荧光素rb515、所述抗cd38抗体连接有荧光素apc-cy7、所述抗cd15抗体连接有荧光素fitc、所述抗cd34抗体连接有荧光素pe-cy5、所述抗cd14抗体连接有荧光素rv444、所述抗cd64抗体连接有荧光素rr664、所述抗cd117抗体连接有荧光素rb608、所述抗cd19抗体连接有荧光素rb780、所述抗cd7抗体连接有荧光素rv480、所述抗cd56抗体连接有荧光素pe、所述抗cd45抗体连接有荧光素rb697、所述抗cd11b抗体连接有荧光素rb730、所述抗hla-dr抗体连接有荧光素apc、所述抗cd123抗体连接有荧光素rv780、所述抗cd13抗体连接有荧光素rb710。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体的制剂为液体制剂或冻干制剂；所有所述抗体包装于一个抗体组合管内。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，在所述液体制剂中，所述抗体的浓度为80～120μg/ml，优选100μg/ml；

5.如权利要求1～4任一项所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，至少包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于，所述孵育的时间为10～20分钟，优选15分钟。

7.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于，所述裂解的时间为10～15分钟，优选10分钟。

8.根据权利要求5所述的使用方法，其特征在于，所述使用方法中的操作均在室温条件下进行。

9.一种急性髓系细胞白血病微小残留病灶的监测方法，其特征在于，至少包括以下步骤：

技术总结
本发明涉及流式细胞术领域，具体讲，涉及一种用于监测急性髓系细胞白血病微小残留病灶(AML‑MRD)的流式细胞术试剂盒及监测方法。本发明试剂盒包括15个抗体，针对髓系细胞的发育模式和抗原表达强度进行检测，通过与正常模式对比即可检测到微量的白血病残留病灶，同时结合全光谱流式细胞仪，可一管panel完成以上所有检测，方便快捷，省时省力，操作简单。

技术研发人员：李西艳,熊慧,李亚洲,吕嫒存,任宗珊
受保护的技术使用者：上海思泰得医学检验实验室有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13