用于监测急性B淋巴细胞白血病微小残留病灶的流式细胞术试剂盒及监测方法与流程

本发明涉及流式细胞术领域，具体讲，涉及一种用于监测急性b淋巴细胞白血病微小残留病灶的流式细胞术试剂盒及监测方法。

背景技术：

1、急性淋巴细胞白血病(all)是原始和幼稚淋巴细胞克隆性增殖的恶性肿瘤，2～5岁儿童多见(19％)，其中b-all更为多见。

2、白血病细胞的自我更新能力增强、增殖失控，可导致分化障碍及凋亡受阻，同时抑制骨髓正常造血并可浸润至肝、脾、淋巴结等各个脏器，表现出感染、出血、贫血等临床征象。all的进展非常迅速，并可能在几个月内导致患者死亡，故确诊后应尽快治疗。目前随着多种药物联合应用、危险度分层评估、预防中枢神经系统侵犯及对化疗失败患者临床、分子生物学和治疗反映特征认识的不断提高，患者的预后得到了显著的改善，5年总生存率(overall survival，os)可达90％。但是，仍有少部分患者复发，复发后二次缓解率低，复发仍然是治疗失败的主要原因。

3、微小残留病(mrd)是指急性白血病患者诱导化疗或骨髓移植后，达到临床和血液学的完全缓解(形态学骨髓中原始及幼稚细胞小于5％)，体内残存少量白血病细胞的状态，mrd是白血病复发的首要原因。因此对于白血病患者来说，检测mrd的意义非常重要：1.有利于更早的预测白血病的复发；2.指导白血病的临床治疗，根据体内白血病细胞多少决定是否继续化疗或停止治疗，更好的制定有效治疗方案，避免过度治疗；3.有利于较早的发现白血病细胞是否耐药，选择临床更敏感，更具有杀伤力的治疗措施；4.有助于评价自体造血干细胞移植患者的干细胞净化效果。

4、近20年来，随着mrd检测技术日新月异，mrd的多种检测方法已被广泛用于临床评估疗效，如流式细胞术(flow cytometry，fcm)、pcr(polymerase chain reaction)、fish以及质谱技术等，mrd技术需要灵敏高，实用性强，准确，可靠，快速。骨髓细胞形态学、常规核型分析以及fish技术由于敏感性低，远远不能满足临床对mrd检测敏感性的要求，目前临床mrd主要的检测方法为fcm和聚合酶链反应。两者均具有高敏感性且相关性良好，二者一致性达89.7％，但是pcr-融合基因只能应用于约25％～40％的all患者中，因为并不是所有all患者都有融合基因或存在突变等，而fcm主要通过检测白血病细胞的发育模式和特异性标志的表达是否正常进行判断，几乎可用于所有患者，检测深度可达到104-5。但是目前传统流式检测通道较少，补偿难调，常用的检测抗体只限于每管8～10个，而已有技术中应用于mrd的流式检测抗体大于20个，因此以往的检测只能选择一线抗体和与b细胞发育模式紧密相关的必要抗体，很难将残留的白血病细胞全部检测到，而all-b的患者如果存在mrd，异常的表达和发育多数不同于初诊，需要更广泛的抗体来监测，因此，检测的抗体广度不足是部分患者mrd检测阴性后仍旧复发的主要原因。

5、2017年全光谱流式的问世，一跃将三激光流式的检测通道从传统流式的4-13个提高到38个，可实现一管25色以上监测，大大提高了检测信息量，提高了诊断精度和免疫学检测的深度。

6、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明第一发明目的在于提供一种用于监测急性b淋巴细胞白血病微小残留病灶的流式细胞术试剂盒。

2、本发明第二发明目的在于提供该试剂盒的使用方法。

3、本发明的第三发明目的在于提供一种急性b淋巴细胞白血病微小残留病灶的流式细胞术试剂盒的监测方法。

4、为了实现本发明的发明目的，采用的技术方案为：

5、本发明涉及一种用于监测急性b淋巴细胞白血病微小残留病灶的流式细胞术试剂盒，所述试剂盒内含有用于检测b系发育的抗体和用于检测异常表达的抗体，

6、所述用于检测b系发育的抗体包括：抗cd19抗体、抗cd10抗体、抗cd20抗体、抗cd34抗体、抗cd38抗体、抗cd81抗体、抗cd58抗体、抗cd45抗体、抗cd24抗体、抗cd200抗体；所述用于检测异常表达的抗体包括：抗cd13抗体、抗cd33抗体、抗cd15抗体、抗cd66c抗体、抗cd123抗体。

7、可选的，所述抗cd33抗体连接有荧光素rb515、所述抗cd38抗体连接有荧光素apc-cy7、所述抗cd15抗体连接有荧光素fitc、所述抗cd24抗体连接有荧光素rv711、所述抗cd123抗体连接有荧光素rv780、所述抗cd58抗体连接有荧光素rb710、所述抗cd200抗体连接有荧光素rv600、所述抗cd19抗体连接有荧光素rb780、所述抗cd66c抗体连接有荧光素rr664、所述抗cd45抗体连接有荧光素rb697、所述抗cd13抗体连接有荧光素rb594、所述抗cd10抗体连接有荧光素pe、所述抗cd81抗体连接有荧光素rr710、所述抗cd20抗体连接有荧光素rv570、所述抗cd34抗体连接有荧光素pe-cy5。

8、可选的，所述抗体的制剂为液体制剂或冻干粉；在所述液体制剂中，所述抗体的浓度为80～120μg/ml，优选100μg/ml。

9、可选的，所有所述抗体包装于一个容器内，优选的，在所述容器内所述抗体质量为80～120μg；更优选的，所述容器的体积为5ml。

10、本发明还涉及该试剂盒的使用方法，至少包括以下步骤：

11、(1)取1个空流式管和一个抗体组合管，标记为对照和样本管；

12、(2)在样本管和对照管中分别加入待测样本，混匀，避光孵育15～20min；

13、(3)在样本管和对照管中分别加入红细胞裂解液，混匀，裂解8～10min；

14、(5)离心，清洗；

15、(6)再匀混，上机检测。

16、可选的，所述孵育的时间为10～20分钟，优选15分钟。

17、可选的，所述裂解的时间为10～15分钟，优选10分钟。

18、可选的，所述使用方法中的操作均在室温条件下进行。

19、本发明还涉及一种监测急性b淋巴细胞白血病微小残留病灶的监测方法，至少包括以下步骤：

20、(1)取1个空流式管和一个抗体组合管，标记为对照和样本管；

21、(2)在样本管和对照管中分别加入待测样本，混匀，避光孵育15～20min；

22、(3)在样本管和对照管中分别加入红细胞裂解液，混匀，裂解8～10min；

23、(5)离心，清洗；

24、(6)再匀混，上机检测；

25、所述抗体组合管含有用于检测b系发育的抗体和用于检测异常表达的抗体，所述用于检测b系发育的抗体包括：抗cd19抗体、抗cd10抗体、抗cd20抗体、抗cd34抗体、抗cd38抗体、抗cd81抗体、抗cd58抗体、抗cd45抗体、抗cd24抗体、抗cd200抗体；所述用于检测异常表达的抗体包括：抗cd13抗体、抗cd33抗体、抗cd15抗体、抗cd66c抗体、抗cd123抗体；所述抗cd33抗体连接有荧光素rb515、所述抗cd38抗体连接有荧光素apc-cy7、所述抗cd15抗体连接有荧光素fitc、所述抗cd24抗体连接有荧光素rv711、所述抗cd123抗体连接有荧光素rv780、所述抗cd58抗体连接有荧光素rb710、所述抗cd200抗体连接有荧光素rv600、所述抗cd19抗体连接有荧光素rb780、所述抗cd66c抗体连接有荧光素rr664、所述抗cd45抗体连接有荧光素rb697、所述抗cd13抗体连接有荧光素rb594、所述抗cd10抗体连接有荧光素pe、所述抗cd81抗体连接有荧光素rr710、所述抗cd20抗体连接有荧光素rv570、所述抗cd34抗体连接有荧光素pe-cy5。

26、本发明至少具有以下有益的效果：

27、本发明的试剂盒包括15个抗体，针对骨髓b细胞的发育模式和all-b常见的异常表达，结合全光谱流式细胞仪，可一管panel完成以上所有检测，方便快捷，省时省力，操作简单。