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RNA质量鉴定方法,你知道几种?众所周知,RNA质量包括完整度和纯度两个方面。 大家知道,低纯度的RNA会严重影响下游的RT-PCR和RT-qPCR反应,特别是RT-qPCR。 如果RNA中含有一些酚类等小分子化合物则会抑制下游的RT-PCR反应; 如果RNA受到DNA等基因组的污染,则会影响qPCR实验数据。 对RNA完整度和纯度进行鉴定,通常我们会通过电泳和OD值的测定。RNA电泳是评估RNA完整性最常用、最简单快速的方法。 RNA电泳 1)完整的RNA通常会有三条带,有的也会两条带(有些试剂盒提取的时候会过滤掉5S条带) 2)最亮的条带为28S条带,其次为18S条带,最淡条带为5S条带;28S条带亮度应为18S条带亮度的2倍左右。 通常在我们得到的电泳结果也会出现多种异常现象,比如: 降解可能出现在提取过程或电泳过程。建议: 1)在RNA提取过程中,应严格操作,全程避免RNA酶的污染,同时保证组织材料的新鲜。 2)在电泳时,应换用新鲜的电泳液,新制备的凝胶,同时应较高电压短时间电泳(20 min)。 出现条带弥散的原因:RNA被核酸酶降解;电压或电流过大;上样量过高或过低等。建议: 1)应避免上述RNA降解出现的问题。 2)控制电压勿过高或过低,一般5—8 V/cm即可;避免电泳时间过长。在电泳开始的前几分钟建议使用低电压。 点样孔发亮 a:RNA样品的污染(含有杂质,如蛋白的残留,可能的原因为RNA提取过程中的操作问题:如氯仿加入量过少,不能充分变性蛋白;氯仿加入量过多,使DNA和蛋白进入水相,影响RNA的提取质量)。 b:胶的问题:如未能凝固好,RNA样品无法很好的往前涌动,同时上样量可能过大。 1)RNA降解(解析见上文)。 2)上样量过大(RNA种类较多,过大上样量会出现除rRNA之外的条带)。 看完RNA电泳,再看看OD值测定 OD值测定 对于核酸分子来讲,因含有嘌呤和嘧啶,他们有共轭双键,在260 nm处有**吸收峰,故核酸的吸收峰在260 nm处。氨基酸中的苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸含共轭体系,在280 nm处有吸收峰,大多数的蛋白质中均含有这些氨基酸,因而蛋白质在280 nm处有**吸收峰。 通常情况下一些盐离子和小分子化合物在230 nm处有吸收峰。 提取之后经过适当纯化、纯度较高的RNA样品,OD260/280在1.9-2.0之间,较纯净的RNA样品OD260/280比值大于2。 核酸提取的过程中,许多试剂都会影响OD260和OD280的读数。 有研究表明,少量异硫氰酸胍的残留会使A230变大,但A260、A280几乎不变。所以A260/A280仍在2.0左右,而A260/A230远低于2.0。 大量异硫氰酸胍的残留会使A230、A260、A280均变大,对于比值的影响无法推测。 PEG残留则会使A230、A260、A280均变大,但对A230和A260影响更大,故使得A260/A280远大于2.0,而A260/A230仍在2.0左右。
文章分类:
文献解读 RNA组学
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