数字PCR仪器： QIAGEN QIAcuity One

技术原理

　　数字PCR( 也可称单分子PCR) 一般包括两部分内容，即PCR 扩增和荧光信号分析。在PCR 扩增阶段，与传统技术不同，数字PCR 一般需要将样品稀释到单分子水平，并平均分配到几十至几万个单元中进行反应。不同于qPCR 对每个循环进行实时荧光测定的方法，数字PCR 技术是在扩增结束后对每个反应单元的荧光信号进行采集。最后通过直接计数或泊松分布公式计算得到样品的原始浓度或含量。数字PCR 的定量方法不依赖于扩增曲线的循环阈值，因此不受扩增效率的影响，也不必采用看家基因和标准曲线，具有很好的准确度和重现性，可以实现绝对定量分析。在未来十年内，医学保健的目标是提供优质高效的个性化医疗。PCR 方法会在实现这个目标的过程中发挥重要作用。相比于传统的PCR，数字PCR 技术有着无可比拟的优势和广泛的应用前景。   

数字PCR检测原理

   数字PCR检测流程

应用领域

      ·突变/稀有变异检测（Mutation/Rare variant detection）   

       ·拷贝数变异（Copy-number variation）   

       ·进入外周循环（包括血液和粪便）的肿瘤组织核酸分析   

       ·无创产前筛查   ·转化移植检测   ·药理学（Pharmacogenetics）   

       ·基因表达分析（Gene expression analysis）-特别针对单细胞或少量细胞或者血清血浆样品   

       ·线粒体拷贝数分析与线粒体突变分析   

       ·数字PCR可以验证二代测序(NGS)

优势

• 不依赖Ct值，无需标准曲线，即可实现真正的绝对定量

• 高精确度、高灵敏度，荧光定量qPCR灵敏度为1%-0.1%，数字化PCR灵敏度可达0.01-0.001%。

• 对干扰分子（背景信号、PCR抑制剂等）耐受度高，通过信号的“有”“无”定量而不是Ct值。

案例

1、数字PCR研究基因表达

遇到基因丰度非常低的，或者样本浓度低的，可以选择数字化PCR，通常CT值大于30的时候，荧光定量qPCR的精确度和重复性会大大降低，这个时候可考虑数字化PCR。

2、外泌体micRNA

       外泌体里面的micRNA含量是非常低的，提取外泌体也是个非常费时费钱的事情，千辛万苦提取出来的样本，保险起见，用数字化PCR是非常不错的一个选择，而且也非常便宜。

3、CNV检测

4、转基因含量检测

5、基因编辑结果验证

6、SNP基因分型

7、德立替尼治疗HR+/HER2-转移性乳腺癌

8、肺癌T790M突变-cfDNA动态监测

9、白血病融合基因检测

参考文献

      · Huggett JF, Foy CA, Benes V et al.(2013) The digital MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments. Clinical Chem 6:892–902.

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      · Detection of Cancer DNA in Plasma of Early Stage Breast Cancer Patients Julia A. Beaver*1, Danijela Jelovac   February 19, 2014 American Association for Cancer Research.

       · Evaluation of a Droplet Digital Polymerase Chain Reaction Format for DNA Copy Number Quantification Leonardo B.   Pinheiro, Victoria A. Coleman,November 28, 2011 American Chemical.   

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       · Tian Wang, Hongying Sha. , et al. Polar Body Genome Transfer for Preventing the Transmission of Inherited   Mitochondrial Diseases。Cell 157, 1591–1604, June 19, 2014.