能够将蛋白通过GPI锚定的方法展示在外泌体膜上的信号肽序列.pdf

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1、(19)国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202211699356.X (22)申请日 2022.12.28 (71)申请人 维思克思生物科技 （武汉） 有限公司 地址 430074 湖北省武汉市东湖新技术开 发区高新大道666号武汉国家生物产 业(九峰创新)基地B4-B8栋B4栋D205 室 (72)发明人 雷祖超宋波曾思远 (74)专利代理机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权 代理有限公司 23211 专利代理师 林娟 (51)Int.Cl. C07K 14/00(2006.01) C07K 19/00(2006.01) C12N 9/。

2、24(2006.01) C12N 5/10(2006.01) A61K 47/46(2006.01) (54)发明名称 一种能够将蛋白通过GPI锚定的方法展示在 外泌体膜上的信号肽序列 (57)摘要 本发明公开了一种能够将蛋白通过GPI锚定 的方法展示在外泌体膜上的信号肽序列， 属于生 物技术领域。 本发明通过将GPI锚定信号肽(氨基 酸序列如SEQ ID NO.5所示)插入在目标蛋白的C 端， 可以将原定位于细胞质中的目的蛋白表达在 外泌体上， 实现目的蛋白的外泌体展示。 由于GPI 锚定蛋白具有较长的脂肪酸链， 赋予目的蛋白在 外泌体上具有更好的柔性， 同时也提高了外泌体 的靶向性， 为外。

3、泌体作为药物载体开拓应用场 景。 权利要求书1页 说明书4页 序列表（电子公布） 附图1页 CN 115850389 A 2023.03.28 CN 115850389 A 1.GPI锚定信号肽在外泌体展示中的应用； 所述GPI锚定信号肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特征在于， 所述应用为将GPI锚定信号肽连接于目的 蛋白的C端。 3.一种融合蛋白， 其特征在于， 所述融合蛋白包含GPI锚定信号肽和目的蛋白； 所述GPI 锚定信号肽连接于目的蛋白的C端。 4.根据权利要求3所述的融合蛋白， 其特征在于， 所述GPI锚定信号肽的氨基酸序列如 SEQ 。

4、ID NO.5所示。 5.一种工程化细胞， 其特征在于， 所述工程化细胞过表达权利要求3或4所述的融合蛋 白。 6.一种提高外泌体靶向性的方法， 其特征在于， 所述方法为在目的蛋白的C端连接GPI 锚定信号肽， 转入宿主细胞， 差速离心法收集外泌体。 7.根据权利要求6所述的方法， 其特征在于， 所述GPI锚定信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。 8.一种外泌体， 其特征在于， 所述外泌体为由表达权利要求3或4所述融合蛋白的宿主 细胞或权利要求5所述工程化细胞来源的外泌体。 9.所述宿主细胞为哺乳动物细胞。 10.权利要求3或4所述融合蛋白或权利要求5所述工程化细胞或权利要求8所述。

5、外泌体 或权利要求6或7所述方法在制备药物载体或药物中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 115850389 A 2 一种能够将蛋白通过GPI锚定的方法展示在外泌体膜上的信 号肽序列 技术领域 0001 本发明涉及一种能够将蛋白通过GPI锚定的方法展示在外泌体膜上的信号肽序 列， 属于生物技术领域。 背景技术 0002 外泌体是细胞由内体途径所分泌的平均直径为30160nm的细胞外囊泡， 具有双层 脂质膜结构， 膜表面带有负电荷， 其内包裹脂质、 蛋白质、 核酸等多种生物活性物质， 不仅在 细胞间物质转换和信息传递等方面起着重要作用， 而且由于外泌体具有低免疫原性、 高生 物安全性、 。

6、高生物相容性及高递送效率等特点， 被认为是新一代的药物递送平台。 此外， 外 泌体膜的磷脂双分子层结构能有效保护内容物， 具有更高的稳定性及更长的半衰期。 但是 天然外泌体存在靶向性较差的问题， 因此需要在其本身脂质双层结构基础上， 使用特定的 表面分子如添加特定的靶向序列进行工程化改造， 从而提高外泌体的靶向性。 0003 目前常用的外泌体改造方法有两种， 一种是通过改造外泌体的供体细胞实现的； 另一种是直接改造外泌体。 对供体细胞的改造主要是通过将靶向分子(如抗体与配体等)与 外泌体膜蛋白进行融合表达实现。 其中常用外泌体膜蛋白分子有Lamp2b、 CD63、 PDGFR、 PTGFRN及。

7、VSVG等， 利用分子生物学手段将靶向分子插入在外泌体膜蛋白分子的胞外域， 进 而将靶向分子展示在外泌体膜表面， 使其具有靶向特定细胞的功能， 但此方法展示的靶向 分子缺乏灵活性， 外泌体的靶向性容易受到靶向分子朝向及刚性等因素的影响； 此外， 还可 以构建脂类(如磷脂等)PEG靶向分子(如抗体、 配体及适配体等)耦联分子， 利用脂质与外 泌体膜融合的特点， 将耦联分子嵌合在外泌体膜表面， 实现靶向分子的外泌体膜展示， 但此 方法需要制备大量的耦联分子， 而且需要多次分离富集外泌体， 造成外泌体的损失， 方法较 为繁琐。 因此亟需一种更好的外泌体靶向分子展示方法。 0004 外泌体膜表面富含糖。

8、基化磷脂酰肌醇锚定蛋白(glycosylphosphatidy linositolanchored protein， GPIAPs)， 或称GPI锚定蛋白， 是一类通过其羧基末端的GPI 结构锚定于细胞膜表面而不跨越其磷脂双层结构的蛋白。 GPI锚定蛋白具有较长的脂肪酸 链， 可以将蛋白以更加柔性的方式展示在膜表面， 作为外泌体膜表面展示靶向分子的良好 工具。 蛋白的独特GPI信号肽使其连接在GPI锚上形成GPI锚定蛋白。 而已报道的GPI锚定信 号肽种类较多， 何种GPI锚定信号肽能够将蛋白通过GPI锚定方式展示在外泌体膜表面， 是 基于GPI锚定蛋白的靶向性工程化外泌体制备的主要问题。 发。

9、明内容 0005 本发明的目的是筛选出一种能够将蛋白通过GPI锚定的方法展示在外泌体膜上的 信号肽序列， 实现GPI锚定的方式构建生产靶向性工程化外泌体的细胞。 0006 本发明的第一个目的是提供GPI锚定信号肽在外泌体展示中的应用。 0007 在一种实施方式中， 所述GPI锚定信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。 说明书 1/4 页 3 CN 115850389 A 3 0008 在一种实施方式中， 所述应用为将GPI锚定信号肽连接于目的蛋白的C端。 0009 在一种实施方式中， 所述目的蛋白为任一特异性靶向特定细胞的蛋白。 0010 在一种实施方式中， 所述特定细胞选自衰老细胞。

10、和异常细胞。 0011 在一种实施方式中， 所述异常细胞包括肿瘤细胞、 异常免疫细胞。 0012 本发明的第二个目的是提供一种融合蛋白， 所述融合蛋白包含GPI锚定信号肽和 目的蛋白。 0013 在一种实施方式中， 所述GPI锚定信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。 0014 在一种实施方式中， 所述GPI锚定信号肽连接于目的蛋白的C端。 0015 在一种实施方式中， 所述目的蛋白为任一特异性靶向特定细胞的蛋白。 0016 在一种实施方式中， 所述特定细胞选自衰老细胞和异常细胞。 0017 在一种实施方式中， 所述异常细胞包括肿瘤细胞、 异常免疫细胞。 0018 本发明的第三个目的。

11、是提供一种工程化细胞， 所述工程化细胞过表达上述融合蛋 白。 0019 在一种实施方式中， 所述工程化细胞为哺乳动物细胞。 0020 在一种实施方式中， 所述哺乳动物细胞包括乳腺癌细胞、 膀胱癌细胞、 骨癌细胞、 宫颈癌细胞。 0021 在一种实施方式中， 所述工程化细胞稳定表达或瞬时表达上述融合蛋白。 0022 本发明的第四个目的提供一种提高外泌体靶向性的方法， 所述方法为在目的蛋白 的C端连接GPI锚定信号肽， 转入宿主细胞， 差速离心法收集外泌体。 0023 在一种实施方式中， 所述GPI锚定信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。 0024 在一种实施方式中， 所述宿主细胞为哺。

12、乳动物细胞。 0025 在一种实施方式中， 所述哺乳动物细胞包括乳腺癌细胞、 膀胱癌细胞、 骨癌细胞、 宫颈癌细胞。 0026 在一种实施方式中， 所述转入为转染。 0027 在一种实施方式中， 所述转染包括稳定转染或瞬时转染。 0028 在一种实施方式中， 所述差速离心法为450550g离心812min， 取上清， 1800 2200g离心1525min， 取上清， 1000012000g离心2040min， 取上清， 1000012000g离心 60120min， 弃上清， 收集沉淀， 利用PBS重悬外泌体沉淀， 1000012000g离心60120min。 0029 本发明的第五个目的是。

13、提供一种外泌体， 所述外泌体为由转染上述融合蛋白的宿 主细胞来源的外泌体。 0030 在一种实施方式中， 所述宿主细胞为哺乳动物细胞。 0031 在一种实施方式中， 所述哺乳动物细胞包括乳腺癌细胞、 膀胱癌细胞、 骨癌细胞、 宫颈癌细胞。 0032 本发明还提供了上述外泌体或上述融合蛋白或上述工程化细胞在制备药物载体 或药物中的应用。 0033 有益效果 0034 本发明通过将GPI锚定信号肽(氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)插入在目标蛋白 的C端， 可以将原定位于细胞质中的目标蛋白表达在外泌体上， 实现目标蛋白的外泌体展 示。 由于GPI锚定蛋白具有较长的脂肪酸链， 赋予目标蛋白在外。

14、泌体上具有更好的柔性， 同 说明书 2/4 页 4 CN 115850389 A 4 时也提高了外泌体的靶向性， 为外泌体作为药物载体开拓应用场景。 附图说明 0035 图1为不同信号肽的序列比较； Seq15所列为五段不同的信号肽的氨基酸序列； 0036 图2为外泌体上5种GPI锚定蛋白信号肽携带蛋白的含量比较。 第1泳道为细胞裂解 液的阳性对照； 第2泳道为转染空质粒细胞外泌体的阴性对照； 第37泳道为转染了不同GPI 锚定信号肽标记Neu1基因细胞外泌体的实验组。 TSG101作为外泌体的标志物， 作为内参， Neu1蛋白在第37泳道中存在表达， 证明对应的GPI锚定信号肽是可以将蛋白携。

15、带进入外泌 体的。 具体实施方式 0037 下面通过具体实施例对本发明所述筛选不同信号肽， 以实现目标蛋白的外泌体展 示过程进一步说明。 以下实施案例只用于对本发明做进一步说明， 不能理解为本发明保护 范围的限制， 所属领域技术人员根据上述发明内容， 对本发明做出一些非实质的改进和调 整进行具体实施， 仍属于发明保护的范围。 0038 实施例1： 构建不同信号肽插入在目标蛋白N端的转染细胞株 0039 本实施例中以细胞质蛋白唾液酸苷酶Neu1为例， 作为外泌体展示的目标蛋白。 0040 通过PCR的方法克隆得到目标蛋白Neu1， 通过PCR方法将不同信号肽序列(图1， 氨 基酸序列如SEQ I。

16、D NO.1SEQ ID NO.5所示)插入在Neu1蛋白的终止密码子前面， 得到连 接有不同信号肽序列的目标蛋白(GPI锚定信号肽Neu1)， 随后与慢病毒载体pLVXAcGFP N1连接， 转化大肠杆菌感受态细胞， 利用菌落PCR方法挑选阳性克隆， 测序验证； 提取质粒， 获得慢病毒表达质粒。 0041 利用脂质体转染试剂， 将构建好的慢病毒表达质粒及包装质粒、 包膜质粒转染进 入汇合度7080的HEK293T细胞中， 37， 5CO2培养4872h， 收集上清， 获得病毒液； 将 病毒液感染膀胱癌细胞YTS1， 通过抗性筛选获得稳定表达具有不同信号肽序列目标蛋白 的稳定细胞株。 0042。

17、 上游引物： 5 ggaattccATGACTGGGGAGCGACCCA3 0043 下游引物： 5 gctctagagcTCA+GPI锚定蛋白信号肽反向互补序列+GAGTGTCCCAT 3 0044 实施例2： 提取稳转细胞株的外泌体 0045 选取实施例1构建的稳转细胞株进行外泌体的提取。 0046 将稳转细胞株接种至DMEM培养基中培养至汇合度为70， 弃培养基， 加入无外泌 体血清的培养基(通过超速离心胎牛血清制备无外泌体血清)， 37， 5CO2浓度条件下， 培 养48h， 收集培养上清为条件培养基， 500g离心10min， 取上清， 2000g离心20min， 取上清， 1100。

18、0g离心30min， 取上清， 110000g离心70min， 弃上清， 收集沉淀。 利用PBS重悬外泌体沉 淀， 110000g离心70min， PBS重悬外泌体沉淀， 得外泌体悬液。 0047 实施例3： 对不同转染细胞株外泌体中目标蛋白的表达进行检测 0048 选取实施例2中的外泌体悬液进行免疫印迹的检测。 0049 向不同的外泌体中加入5loading buffer， 沸水浴煮沸10min， 进行免疫印迹检 说明书 3/4 页 5 CN 115850389 A 5 测， 观察不同外泌体中是否含有目标蛋白， 如该外泌体中目标蛋白含量较其他组有显著的 提高， 说明该组所使用的信号肽可以携带。

19、蛋白质到外泌体上。 0050 如图2所示， 泳道1为以稳定表达Neu1细胞株的裂解液为阳性对照， 泳道2为转染了 空载体(没有连接Neu1及信号肽)的细胞的外泌体作为阴性对照， 泳道37分别为连接有氨 基酸序列如SEQ ID NO.1EQ ID NO.5所示的GPI锚定信号肽的稳定表达Neu1细胞株的外 泌体。 从图2A及2B上可见， 稳定表达Neu1细胞株中富含细胞质蛋白Neu1， 而其分泌的外泌体 中不含有Neu1； 连接有氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示的GPI锚定蛋白信号肽不能把细 胞质蛋白Neu1包装进入外泌体， 而连接有氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的GPI锚定蛋白信 号肽可以将Neu1蛋白以GPI锚定蛋白方式展示在外泌体上。 0051 虽然本发明已以较佳实施例公开如上， 但其并非用以限定本发明， 任何熟悉此技 术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内， 都可做各种的改动与修饰， 因此本发明的保护范 围应该以权利要求书所界定的为准。 说明书 4/4 页 6 CN 115850389 A 6 图1 图2 说明书附图 1/1 页 7 CN 115850389 A 7 。