1.1.1 菌株来源

多粘类芽孢杆菌由浙江工业大学微生物研究所保藏。

1.1.2 培养基

固体培养基(g· L^-1):牛肉膏10.0, 蛋白胨15.0, 葡萄糖10.0, 酵母粉2.0, 氯化钠3.0, FeSO₄· 7H₂O 0.1, 琼脂20.0, pH 7.0, 115 ℃灭菌30 min。

种子培养基^{[ 16]}, pH 7.0, 115 ℃灭菌30 min。

发酵培养基^{[ 16]}, 初始发酵培养基中含有45 g· L^-1葡萄糖(对照组), 其他试验组分别含有45 g· L^-1的可溶性淀粉、乳糖、蔗糖、麦芽糖, pH 7.0, 115 ℃灭菌30 min。

LC-20AD岛津液相色谱仪(日本岛津公司), PB-10 pH计(德国Sartorius公司), ZHWY-2112B恒温培养振荡器(上海智诚分析仪器制造有限公司), SW-CJ-1F超净工作台(苏净集团安泰公司)。葡萄糖、蔗糖(广东光华化学厂有限公司), 麦芽糖、乳糖(上海伯奥生物科技有限公司), 可溶性淀粉(国药集团化学试剂有限公司)。

斜面培养:将多粘类芽孢杆菌单菌落接种于新鲜斜面, 30 ℃恒温培养48 h。

1级种子培养:将多粘类芽孢杆菌新鲜的斜面菌种接种于装液量50 mL/250 mL三角瓶的1级种子培养基中, 摇床转速200 r· min^-1, 30 ℃培养24 h。

2级种子培养:将1级种子液以10%接种量接种于装液量100 mL/500 mL三角瓶的2级种子培养基中, 摇床转速200 r· min^-1, 30 ℃培养24 h。

摇瓶发酵培养:按10%接种量将2级种子培养液接种于装液量50 mL/250 mL三角瓶的发酵培养基中, 摇床转速200 r· min^-1, 30 ℃培养96 h。

试验共设蔗糖、乳糖、麦芽糖和可溶性淀粉4个处理, 以葡萄糖为对照组, 每个处理重复3次, 发酵期间每12 h取样测定其pH、还原糖、总糖、生物量和多粘菌素E效价等参数。还原糖和总糖含量测定采用3, 5-二硝基苯酚法(DNS法)^{[ 17, 18]}; pH测定采用PB-10 pH计测定; 生物量测定采用平板计数法^{[ 19]}; 多粘菌素E效价的测定采用HPLC法^{[ 20]}。

利用Excel和Statview统计软件进行数据分析和差异显著度分析, 数据处理后用Origin 8.0绘图。

1.5.1 多粘菌素E相对效价的计算

根据公式(1)和(2)计算多粘菌素E的效价和相对效价。

Y=(X× 0.00452-1723.76113)× B。 (1)

式(1)中:Y为发酵液多粘菌素E效价(U· mL^-1); X为液相图谱峰面积; B为稀释倍数; 0.004 52和1 723.761 13分别表示多粘菌素E标准曲线的x斜率和y轴截距; 此标准曲线由实验室以多粘菌素E硫酸盐标准样品的水溶液制作。

Y_R=Y_T/Y_EP× 100%。 (2)

式(2)中:Y_T为T时刻各取样点发酵液样品多粘菌素E的效价(U· mL^-1); Y_EP为葡萄糖对照组发酵终点时多粘菌素E的效价(U· mL^-1); Y_R为多粘菌素E的相对效价(%)。

1.5.2 单位菌体多粘菌素E相对效价的计算

根据公式(3)和(4)计算单位菌体多粘菌素E的相对效价Y_PR(%), 用于表征碳源对多粘菌素E合成能力的影响。

Y_PB=Y_P/B_max。 (3)

式(3)中:Y_P为发酵终点各组的效价(U· mL^-1); B_max为发酵过程菌体生物量的最大值(10⁶ cfu· mL^-1), 以10⁶ cfu为1个菌体单位; Y_PB为各组发酵终点的效价与最大菌体生物量的比值(U· 10⁶ cfu^-1)。

Y_PR=Y_PB/Y_PG× 100%。 (4)

式(4)中:Y_PB为试验组发酵终点的效价与最大菌体生物量的比值(U· 10⁶ cfu^-1); Y_PG为对照组发酵终点的效价与最大菌体生物量的比值(U· 10⁶ cfu^-1); Y_PR则为单位菌体多粘菌素E的相对效价(%)。

1.5.3 多粘菌素E相对合成速率的计算

由公式(5)和公式(6)分别计算试验组和对照组各个时间段多粘菌素E的合成速率(U· mL^-1· h^-1)和相对合成速率(%), 用于表征碳源对多粘菌素E合成速率的影响。

Y_S=(Y_Rn-Y_Rr)/12。 (5)

式(5)中:Y_Rn-Y_Rr为各组单位体积发酵液中每12 h合成的多粘菌素E的量(U· mL^-1); Y_S为每h多粘菌素E的平均合成速率(U· mL^-1· h^-1)。

则相对速率为Y_SR=Y_SCM/Y_SGM× 100%。 (6)

式(6)中:Y_SCM为试验组多粘菌素E的最大合成速率(U· mL^-1· h^-1); Y_SGM为葡萄糖对照组多粘菌素E的最大合成速率(U· mL^-1· h^-1); YSR为多粘菌素E的相对合成速率(%)。

1.5.4 碳源转化为多粘菌素E相对转化率的计算

根据公式(7)和(8)计算碳源的相对转化率

C=Y_F/(M_S-M_F)。 (7)

式(7)中:C为碳源转化为多粘菌素E的转化率(U· g^-1); M_S-M_F为单位体积发酵液中碳源的消耗量, 即初始培养基添加量与发酵结束后培养基残留量的差值(g· L^-1); Y_F为发酵终点多粘菌素E的效价(U· L^-1)。

则相对转化率为C_R=C_SM/C_GM× 100%。(8)

式(8)中:C_R为碳源转化为多粘菌素E的相对转化率(%); C_SM为发酵过程中试验组碳源转化为多粘菌素E的转化率(U· g^-1); C_GM为发酵过程中对照组葡萄糖转化为多粘菌素E的转化率(U· g^-1)。

将相同含量的多粘类芽孢杆菌接入不同质量浓度葡萄糖的液体培养基中, 30 ℃培养22 h, 取样, 测定D₆₀₀, 结果如图1所示。培养基中初始葡萄糖浓度小于20 g· L^-1有利于多粘类芽孢杆菌的生长, 当葡萄糖浓度达到20 g· L^-1时, 液体培养基中菌体含量达到最大值。葡萄糖浓度大于20 g· L^-1会抑制多粘类芽孢杆菌的生长, 葡萄糖质量浓度越高, 菌体生长受抑制程度越严重。当葡萄糖浓度为50 g· L^-1时, 其最大菌体含量仅为以20 g· L^-1葡萄糖最大菌体含量的64%。表明一定浓度的葡萄糖促进多粘类芽孢杆菌的生长, 而高浓度的葡萄糖则会抑制多粘类芽孢杆菌的生长。

图1

Fig.1

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Fig.1 The growth curve of Paenibacillus polymyxa in different concentrations of glucose'>	图1 不同葡萄糖质量浓度下多粘类芽孢杆菌的生长曲线Fig.1 The growth curve of Paenibacillus polymyxa in different concentrations of glucose

将多粘类芽孢杆菌按照1.3节的方法进行培养, 由图2可知, 不同碳源培养基中多粘类芽孢杆菌的生长趋势相似。在发酵0— 12 h, 葡萄糖对照组多粘类芽孢杆菌开始快速生长, 但此时的菌体含量相对最少, 之后菌体开始快速生长, 在36 h生物量最先达到最高值, 可能葡萄糖作为速效碳源被菌体迅速利用, 从而促进菌体生长; 发酵36 h后菌体开始进入衰亡期, 多粘类芽孢的生长受到抑制。在蔗糖、乳糖和麦芽糖试验组中, 发酵48 h内菌体处于快速生长期, 之后菌体开始进入衰亡期。而在可溶性淀粉试验组中, 发酵0— 60 h, 多粘类芽孢杆菌处于快速生长期, 至60 h菌体量达到最大, 可能因为可溶性淀粉的利用需要菌体合成的淀粉酶将其分解为葡萄糖才能进入同化途径供给菌体生长, 有一定的生长延迟现象。5组试验组中, 可溶性淀粉试验组的生物量最后达到最高。

图2

Fig.2

	Figure Option Fig.2 Influence of carbon sources on the growth of Paenibacillus polymyxa during polymyxin E fermentation'>View Download New Window
Fig.2 Influence of carbon sources on the growth of Paenibacillus polymyxa during polymyxin E fermentation'>	图2 多粘菌素E发酵过程中碳源对多粘类芽孢杆菌生长的影响Fig.2 Influence of carbon sources on the growth of Paenibacillus polymyxa during polymyxin E fermentation

培养基pH值是菌体生长代谢的重要表征, 对抗生素的合成至关重要^{[ 21]}。由图3-A可知, 各试验组发酵过程中, pH变化趋势基本相同, 由于碳源的快速消耗, pH值呈现下降趋势; 发酵36 h后, 不同碳源引起的pH值差异趋于明显, 其中, 葡萄糖对照组pH呈现最高值, 而可溶性淀粉试验组的pH值维持在最低水平。从图3-B和3-C可知, 在发酵过程中, 各试验组对糖的利用趋势相似; 发酵开始后, 各试验组还原糖含量迅速下降, 发酵48 h后葡萄糖对照组的还原糖含量不再变化, 维持在最高水平, 而可溶性淀粉试验组的还原糖含量维持在最低水平; 各试验组的总糖含量基本维持在相同水平。

图3

Fig.3

	Figure Option Fig.3 Influence of carbon sources on pH, reducing sugar and total sugar during polymyxin E fermentation'>View Download New Window
Fig.3 Influence of carbon sources on pH, reducing sugar and total sugar during polymyxin E fermentation'>	图3 碳源对多粘菌素E发酵过程中pH值、还原糖和总糖的影响Fig.3 Influence of carbon sources on pH, reducing sugar and total sugar during polymyxin E fermentation

从图4-A可见, 不同碳源对多粘菌素E产量的影响不同, 其最终效价依次为可溶性淀粉> 乳糖> 蔗糖> 麦芽糖> 葡萄糖。其中, 可溶性淀粉和乳糖试验组的多粘菌素E合成能力高于其他组, 其最终相对效价分别是以葡萄糖对照组的2.11和1.58倍。可溶性淀粉试验组中, 多粘类芽孢杆菌在12 h开始合成多粘菌素E, 葡萄糖对照组和其他试验组在24 h才开始合成多粘菌素E。对比图3-B和图3-C, 推测高浓度的葡萄糖不利于多粘菌素E的合成, 而可溶性淀粉试验组中淀粉酶的缓慢释放所产生低浓度的还原糖没有葡萄糖效应, 有利于多粘菌素E的生物合成。从图4-B多粘菌素E合成速率可知, 不同试验组中多粘菌素E的合成速率趋势相似, 均在36~48 h达到最大合成速率, 之后开始下降。发酵84 h之后, 葡萄糖对照组、蔗糖试验组和麦芽糖试验组的合成速率降为0, 而乳糖试验组和可溶性淀粉试验组依然可以维持一定的合成速率。葡萄糖对照组合成速率最高值相对最低, 乳糖试验组和可溶性淀粉试验组的相对合成速率最大, 分别比葡萄糖对照组高51%和60%, 说明非速效碳源— — 乳糖和可溶性淀粉可以提高多粘菌素E的合成速率, 同时相对延长合成时间, 从而提高多粘菌素E的产量。

图4

Fig.4

	Figure Option Fig.4 Influence of carbon sources on relative polymyxin E production and relative synthetic rate of polymyxin E'>View Download New Window
Fig.4 Influence of carbon sources on relative polymyxin E production and relative synthetic rate of polymyxin E'>	图4 碳源对多粘菌素E相对效价及相对合成速率的影响Fig.4 Influence of carbon sources on relative polymyxin E production and relative synthetic rate of polymyxin E

多粘菌素E是在细胞内合成的, 其合成与细胞的生长有一定的相关性。根据1.5.2节公式(3)和(4)计算单位菌体的多粘菌素E产量, 横坐标表示不同碳源的试验组别, 结果见图5。可溶性淀粉试验组中单位菌体合成多粘菌素E的能力最强, 乳糖试验组次之, 葡萄糖对照组最低, 推测乳糖和可溶性淀粉可以调节多粘类芽孢杆菌的次级代谢, 促进多粘菌素E的生物合成。

图5

Fig.5

	Figure Option Fig.5 Influence of carbon sources on the polymyxin E production per unit biomass'>View Download New Window
Fig.5 Influence of carbon sources on the polymyxin E production per unit biomass'>	图5 碳源对单位菌体多粘菌素E产量的影响Fig.5 Influence of carbon sources on the polymyxin E production per unit biomass

根据1.5.4节方法计算不同碳源的相对转化率, 结果如图6所示。在发酵过程中不同碳源的多粘菌素E转化效率不同。在各试验组中, 可溶性淀粉— 多粘菌素E的相对转化率最高, 乳糖— 多粘菌素E的相对转化率次之, 葡萄糖— 多粘菌素E的相对转化效率最低。由此可知, 可溶性淀粉更有利多粘类芽孢杆菌合成多粘菌素E。

图6

Fig.6

	Figure Option Fig.6 The relative conversion efficiency of carbon sources to the polymyxin E production'>View Download New Window
Fig.6 The relative conversion efficiency of carbon sources to the polymyxin E production'>	图6 碳源转化为多粘菌素E的相对效率Fig.6 The relative conversion efficiency of carbon sources to the polymyxin E production

由上述试验结果可知, 多粘类芽孢杆菌在不同碳源条件下进行发酵, 其合成多粘菌素E的结果不同, 将其主要发酵参数进行汇总, 结果见 表1。由 表1可知, 各试验组消耗的碳源无明显差别, 最大生物量相近, 但是多粘菌素E相对效价相差较大, 其中, 以可溶性淀粉为碳源的试验组相对效价最高、合成速率最快、单位菌体合成能力最强, 其最大值分别为葡萄糖对照组的211%、160%和197%。上述结果表明, 多粘类芽孢杆菌利用可溶性淀粉转化为多粘菌素E的效率高, 合成速率快, 使单位菌体合成多粘菌素E的能力增强, 因此, 可溶性淀粉是多粘菌素E生物合成的最适碳源。

表1

Table 1

表1(Table 1)

表1 不同碳源培养基中多粘类芽孢杆菌合成多粘菌素E的比较 Table 1 The comparison of the synthesis of polymyxin E by Paenibacillus polymyxa in the culture medium containing different carbon sources 碳源Carbon sources B /[Lg(cfu· mL-1)] RPP /% RRB /% PPB /% SC /g RCE /% 葡萄糖Glucose 8.008± 0.02 100± 3.7 100± 1 100± 1.26 32± 0.97 100± 0.36 蔗糖Sucrose 7.95± 0.03 124± 4.4* 112± 10* 134± 2.64* * 30.4± 0.79 130± 1.04* * 乳糖Lactose 7.98± 0.03 158± 6.17* * 151± 12* * 168± 1.89* * 31.19± 0.84 158± 1.06* * 麦芽糖Maltose 7.95± 0.03 116± 4.0 102± 8.6 131± 2.64* * 33.38± 0.78 111± 1.03 可溶性淀粉Soluble starch 8.049± 0.01 211± 5.7* * 160± 18* * 197± 3.27* * 30.84± 0.91 225± 1.061* * The relative polymyxin E production, polymyxin E production per unit biomass and the relative conversion efficiency of glucose control group is 100%. B, Biomass; RPP, Relative polymyxin E production; RRB, Relative rate of biosynthesis; PPB, Polymyxin E production per unit biomass; RCE, The relative conversion efficiency; SC, Sugar consumption. * and * * represent significant difference at 0.05 and 0.01 level compared with the glucose control group, respectively. 设葡萄糖对照组最终效价、单位菌体效价和转化率为100%。B, 生物量; RPP, 相对效价; RRB, 相对合成速率; PPB, 单位菌体效价; SC, 糖耗; RCE, 相对转化率。* 和* * 分别表示与葡萄糖对照组相比差异显著(P< 0.05)和极显著(P< 0.01)。

表1 不同碳源培养基中多粘类芽孢杆菌合成多粘菌素E的比较 Table 1 The comparison of the synthesis of polymyxin E by Paenibacillus polymyxa in the culture medium containing different carbon sources