【耀文解读】ｍＲＮＡ篇｜ｍRNA序列优化——mRNA 5'UTR序列优化致翻译效率最大化提高方法解读
作者： 江苏耀海生物CDMO
| 发布于: 修改于: | 雪球 | 转发：0 | 回复：0 | 喜欢：1 |
早在上世纪六十年代就有人开始利用RNA转染细胞，但是直到1990年，发现通过肌肉注射 mRNA在小鼠体内竟可以翻译出靶标蛋白，然而经过长期理论实践积累直到最近几年，基于mRNA的治疗方法在各个疾病领域才开始出现重大的进展。基于mRNA技术的肿瘤疫苗和预防病毒感染的mRNA疫苗在临床试验中展现出令人鼓舞的前景，所以严格意义上来讲虽然mRNA技术发现已久但是对于人类来说依旧是一个非常新兴前沿的治疗技术与方向。心力衰竭、糖尿病创伤治疗、血管疾病的mRNA再生疗法也已经进入临床试验，同时骨修复治疗也正在快速推进中。mRNA编码的转录因子可以非常有效地诱导产生多潜能干细胞。此外，基于mRNA技术的基因编辑工具不仅非常有潜力，而且要比基于蛋白或者病毒载体理论上相对更加安全。mRNA技术作为一种平台型的治疗手段，在逐步展现出自身所具有的独特优势的无限潜能。
外源合成的 mRNA分子在体内充分发挥治疗效果主要取决于递送进细胞内的mRNA分子高效地翻译出治疗性蛋白，并执行特定的生物学功能。因此，研发人员采用多种手段来提升mRNA的翻译效率。在mRNA分子中插入修饰核苷酸以减少外源性mRNA分子的免疫原性，宾夕法尼亚大学的Kariko ́首次证实携带假尿嘧啶核苷酸的mRNA可以降低其与TLRs的结合率。Carsten Rudolph等发现，将mRNA序列中25%的尿嘧啶和胞嘧啶替换为1-硫脲尿嘧啶和5-甲基胞嘧啶，可以降低mRNA同TLR3/TLR7/TLR8的结合率。Thomas Schlake等没有使用修饰核苷酸，而是仅仅采用序列优化的方式来提升mRNA的翻译效率，降低天然免疫反应。
其实在本次介绍筛选最短5’UTR序列实现翻译高效率之前，我们已经对 mRNA优化做出了一系列阐释，详见 【星耀小课堂】mRNA合成|In Vitro Transcription并非想象的那么简单。在过去这篇IVT反应介绍中提到，在真核细胞中核糖体亚基需要经过5ʹUTR到达起始密码子AUG处,从而开始翻译，因此5ʹUTR的长度和结构对翻译的起始意义非凡。设计要点如下：①在设计mRNA时5ʹUTR不能太长（紧密的二级结构会阻止核糖体与5’7Gcap结合）；②应避免在5ʹUTR区域引入上游开放阅读框序列（可能会抑制ORF区基因的表达，也可能导致mRNA的降解）和起始密码子AUG；③在5ʹUTR区域引入强的Kozak序列(GCCRCCAUGG,R代表嘌呤)，可以加强起始密码子的识别,让mRNA更容易被翻译
除了修饰核苷酸，构成 mRNA元件的非编码区序列对于细胞内的翻译效率也会产生重要影响。与3'UTR序列相比，5'UTR序列要更短，长度一般在100-200核苷酸。Carsten Rudolph等在一项研究中比较了5个不同的UTR序列对于mRNA稳定性和翻译效率的影响，结果显示人细胞CYBA（别名：PHOX，P22phox，全称 cytochrome b-245，alpha polypeptide，中文名为还原型辅酶叶绿醇。CYBA基因位于第16号染色体16q24位置，全长7,760bp，含8个外显子，mRNA长688nt，编码由195个氨基酸残基组成的蛋白质。）的UTR序列可以在不影响RNA半衰期的情况下增强翻译效率。有人发现双拷贝的beta globin 3'-UTR序列在树突细胞中支持蛋白的高效表达。在过往研究中使用到的UTR序列包括：来自CMV（Cytomegalovirus，人类巨噬细胞病毒 )的增强子序列，人alpha-globin （α-珠蛋白）5'UTR、人生长激素UTR序列、非洲爪蟾蜍beta-globin（β-珠蛋白） UTR等。、
UTR对于 mRNA翻译效率的影响不仅与细胞类型有关，而且高度依赖二级结构。在RNA分子中插入修饰核苷酸时可能影响RNA的二级结构，从而可能会导致UTR丧失介导蛋白翻译的功能。因此为克服这些限制，所以相对较短的设计UTR能更好的完成预设目的，设计出最短的UTR序列是非常有必要的，既可以免受细胞类型差异的影响，又能够在插入修饰核苷酸时使其对翻译效率的影响降至最弱。
2019年， Carsten Rudolph在Tissue Engineering发表文章：Maximizing the Translational Yield of mRNA Therapeutics by Minimizing 5'-UTRs，旨在将最短的5'UTR序列和修饰核苷酸结合在一起来提升外源mRNA翻译效率。今天，菌菌带带大家跟随文献的思路解读一下，研发人员是如何来筛选到最短的5'UTR序列并且实现翻译效率的最大化。
最短5'UTR序列设计
研发人员为合成出携带7种不同的最短5'UTR序列的 mRNA，将翻译起始密码子上游的T7启动子序列（TAATACGACTCTATA）和Kozak保守元件(Kozak consensus sequence，是位于真核生物mRNA 5’端帽子结构后面的一段核酸序列，通常是GCCACC，它可以与翻译起始因子结合而介导含有5’帽子结构的mRNA翻译起始，对应于原核生物的SD序列。存在于真核生物mRNA的一段序列，其在翻译的起始中有重要作用)融合在一起，形成UTR1序列。RNA是从T7启动子序列TATA元件后的第一个G开始转录的。在体外转录的时候，TATA元件后面的6个碱基（GGGAGA）对于转录产量和转录出来的mRNA5'末端的同质性是必需的。为进行比较，研发人员将T7启动子序列和完整的Kozak保守序列（GCCGCCACC）融合在一起，即在GGGAGA和GCCACC之间插入C，形成min UTR2序列。
7种不同的极短5'UTR候选序列
T7启动子和Kozak元件之间的间隔核苷酸的影响
修饰核苷酸组合1由25% 1-硫脲尿嘧啶和25% 5-甲基胞嘧啶组成。修饰核苷酸组合2由35% 5-碘尿嘧啶以及7.5% 5-碘-胞嘧啶组成。无论是采用修饰核苷酸组合1/2，还是未修饰核苷酸，携带UTR2序列的Luciferase-mRNA转染A549细胞和HepG2细胞后，在不同的时间点，其在细胞内翻译出来的荧光蛋白表达量均明显高于携带UTR1序列的Luciferase-mRNA。因此，UTR序列筛选以UTR2序列作为模板，在此基础上，进一步优化设计。
携带UTR1和UTR2的luciferase-mRNA转染细胞后，细胞内荧光蛋白的表达量
研发人员以UTR2序列为模板序列，然后在T7启动子序列和Kozak保守元件序列之间的-7位置插入T/A/C/G，设计出UTR3-6候选序列，以此来研究增加T7启动子序列和Kozak元件之间的距离对 mRNA翻译效率的影响。用修饰核苷酸或者未修饰苷酸合成携带UTR3-6的Luciferase-mRNA，再转染细胞，以携带人alpha-globin 5'UTR序列的Luciferase-mRNA（荧光素酶-mRNA）作为阳性对照，观察转染细胞。结果发现只有携带UTR3序列的Luciferase-mRNA在A549细胞中的荧光蛋白表达量接近或者优于携带人alpha-globin 5'UTR序列的Luciferase-mRNA。
携带不同5’UTR序列的luciferase-mRNA转染A549细胞后，细胞内荧光蛋白表达量
翻译调控序列的影响
在真核细胞中大概有5%的编码蛋白的基因存在一种非常独特的保守的短5'UTR序列，称为TISU序列。因此，以UTR3序列作为模板，用TISU序列替换Kozak序列产生UTR7序列。当使用未修饰核苷酸时，携带UTR3或者UTR7的Luciferase-mRNA在A549细胞和HepG2细胞中的荧光蛋白表达量在不同时间点大致是相当的。当使用修饰核苷酸组合1时，携带UTR7的Luciferase-mRNA在A549细胞和HepG2细胞中的荧光蛋白表达量要优于携带UTR3的Luciferase-mRNA。相反，当使用修饰核苷酸组合2时，携带UTR3的Luciferase-mRNA在A549细胞中的荧光蛋白表达量要优于携带UTR7的Luciferase-mRNA。也就是说，不同的细胞类型和修饰苷酸酸对于UTR3和UTR介导的 mRNA翻译效率的影响程度是不相同的。
携带Kozak元件和TISU元件的Luciferase-mRNA转染A549和HepG2细胞，细胞内荧光蛋白的表达量
不同UTR序列对于体内翻译效率的影响
采用修饰核苷酸组合1合成携带UTR3和UTR7的Luciferase-mRNA，并且用携带人alpha-globin（refUTR1）的Luciferase-mRNA和携带来自人CMV增强子的5'UTR（refUTR2）和来自人生长激素的3'UTR的Luciferase-mRNA作为阳性对照，包封 mRNA，静脉注射到小鼠体内。荧光活体成像显示，与体外翻译类似，携带UTR3的Luciferase-mRNA在小鼠体内的翻译效率与携带人alpha-globin 5'UTR的Luciferase-mRNA大致相当。携带UTR7的Luciferase-mRNA在小鼠体内的翻译效率要优于携带'UTR3的Luciferase-mRNA。
在小鼠体内注射携带不同UTR的Luciferase-mRNA后，体内荧光蛋白的表达量
UTR7优越的翻译效率独立于CDS序列
为了验证UTR7卓越的翻译效率是否独立于CDS序列，研发人员合成出编码人红细胞生成素的携带UTR7的hEPO-mRNA，采用修饰核苷酸组合1合成，转染细胞。结果发现，与对照组相比，携带UTR7的Luciferase-mRNA在两种类型细胞中的翻译效率依然具有一定程度的优越性。
编码人红细胞生成素的携带UTR7的hEPO-mRNA在细胞中的翻译效率
总结
mRNA 5'UTR序列中包含能够被细胞特异性的RNA结合蛋白识别的结构元件，介导mRNA的翻译起始过程。在合成外源mRNA时加入修饰核苷酸，可以减轻mRNA转染细胞后触发的天然免疫反应。但修饰核苷酸的加入亦反过来影响mRNA的二级结构，从而对mRNA在细胞中的翻译效率造成影响。研发人员设计合成出7种极短的5'UTR序列，测试其在细胞和小鼠体内的翻译效率以及修饰核苷酸对其介导的翻译效率的影响，结果发现只有17nt的UTR7无论在细胞还是小鼠体内均可以达到类似或者优于广泛使用的37nt的人alpha-globin 5'UTR序列的蛋白翻译效率。
下面菌菌的小TIP分享一些UTR优化设计时需要特别注意的细节：
（1）T7启动子序列可以分为两个结构域：从-17到-5的上游结合结构域；从-4到+6的转录起始结构域。对于转录起始结构域来说，任何碱基的替换都会严重影响到启动子的强度，因此在设计UTR序列时采用原始的GGGAGA序列最佳。
（2）在早期的研究中，发现在699个脊椎动物的 mRNA 5端非编码序列中，在-9的位置33%的概率会出现G，而在-7的位置37%的概率会出现C，因此更加完全的Kozak序列是GCCGCCACC。在将Kozak序列和GGGAGA融合的时候，在两种之间-7的位置插入C，会使得原先位于-8位置上的G移动到-9位置上，更加符合完全的Koza序列特征，后续试验数据也证实-7位置C的插入可以显著提升翻译效率。
（3）从翻译起始密码子算起，在5'UTR序列+8位置插入T与插入其他核苷酸相比，无论是否使用修饰核苷酸，均会提升翻译效率。
（4）先前有研究报道，确保翻译起始的 mRNA5'端序列最短长度是32nt。如果少于32nt，翻译将会在起始密码子下游的ATG起始。与此相反的是，在本文中合成的5'UTR序列少于15nt，在细胞和体内均具有非常不错的表达效率。同时还将之前发现的极短翻译调控元件TISU(AAGAUGG)融合在设计的5'UTR序列，这与经典的Kozak序列（RCCAUGG）拥有完全不同的序列特征。此外，Kozak序列在起始密码子前面含有2个C，而TISU在起始密码子前面缺乏C，因此，不同的修饰胞嘧啶核苷酸（5-甲基胞嘧啶或者5-碘胞嘧啶）对于携带这两种不同呢翻译调控元件的5'UTR序列的影响是不尽相同的。
参考文献
[1] Arnaud-Barbe N, Cheynet-Sauvion V, Oriol G, Mandrand B, Mallet F. Transcription of RNA templates by T7 RNA polymerase. Nucleic Acids Res. 1998;26(15):3550-3554.
[2] Gholamalipour Y, Karunanayake Mudiyanselage A, Martin CT. 3' end additions by T7 RNA polymerase are RNA self-templated, distributive and diverse in character-RNA-Seq analyses. Nucleic Acids Res. 2018 Oct 12;46(18):9253-9263.
[3] Krupp G. RNA synthesis: strategies for the use of bacteriophage RNA polymerases. Gene. 1988 Dec 10;72(1-2):75-89.
[4] Cheetham GM, Jeruzalmi D, Steitz TA. Structural basis for initiation of transcription from an RNA polymerase-promoter complex. Nature. 1999 May 6;399(6731):80-3.5. BIA Separations-Purification of single-stranded mRNA : The toolbox for the next generation
